امونوموڊوليٽري ميٽابولائٽس ٽيومر مائڪرو ماحول (TME) جي هڪ اهم خصوصيت آهن، پر ڪجهه استثنائن سان، انهن جي سڃاڻپ وڏي حد تائين اڻڄاتل رهي ٿي. هتي، اسان انهن مختلف TME حصن جي ميٽابولوم کي ظاهر ڪرڻ لاءِ اعليٰ درجي جي سيرس ڪارڪينوما (HGSC) وارن مريضن جي ٽيومر ۽ ايسائٽس مان ٽيومر ۽ ٽي سيلز جو تجزيو ڪيو. ايسائٽس ۽ ايسائٽس ۾ وسيع ميٽابولائٽ فرق آهن. ايسائٽس جي مقابلي ۾، ٽيومر ۾ داخل ٿيندڙ ٽي سيلز 1-ميٿائلنيڪوٽينامائيڊ (MNA) ۾ خاص طور تي افزوده آهن. جيتوڻيڪ ٽي سيلز ۾ MNA جي سطح بلند آهي، نيڪوٽينامائيڊ N-ميٿائل ٽرانسفريز (هڪ اينزائم جيڪو S-اڊينوسائلميٿيونائن کان نيڪوٽينامائيڊ تائين ميٿائل گروپن جي منتقلي کي ڪيٽيلائيز ڪري ٿو) جو اظهار فائبروبلاسٽس ۽ ٽيومر سيلز تائين محدود آهي. فنڪشنل طور تي، MNA ٽي سيلز کي ٽيومر کي فروغ ڏيڻ واري سائيٽوڪائن ٽيومر نيڪروسس فيڪٽر الفا کي خارج ڪرڻ لاءِ متاثر ڪري ٿو. تنهن ڪري، TME مان نڪتل MNA ٽي سيلز جي مدافعتي ضابطي ۾ حصو وٺندو آهي ۽ انساني ڪينسر جي علاج لاءِ هڪ امڪاني اميونوٿراپي ٽارگيٽ جي نمائندگي ڪندو آهي.
ٽيومر مان نڪتل ميٽابولائٽس اينٽي ٽيومر مدافعت تي گہرا روڪڻ وارو اثر رکي سگهن ٿا، ۽ وڌيڪ ۽ وڌيڪ ثبوت ڏيکارين ٿا ته اهي بيماري جي واڌ لاءِ هڪ اهم محرڪ قوت طور پڻ ڪم ڪري سگهن ٿا (1). واربرگ اثر کان علاوه، تازو ڪم ٽيومر سيلز جي ميٽابولڪ حالت ۽ ٽيومر مائڪرو ماحول (TME) جي مدافعتي حالت سان ان جي تعلق کي بيان ڪرڻ شروع ڪيو آهي. مائوس ماڊلز ۽ انساني ٽي سيلز تي ڪيل مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته گلوٽاامين ميٽابولزم (2)، آڪسائيڊيوٽ ميٽابولزم (3) ۽ گلوڪوز ميٽابولزم (4) مختلف مدافعتي سيل ذيلي گروپن تي آزاديءَ سان ڪم ڪري سگهن ٿا. انهن رستن ۾ ڪيترائي ميٽابولائٽس ٽي سيلز جي اينٽي ٽيومر ڪم کي روڪين ٿا. اهو ثابت ٿيو آهي ته ڪوئنزائم ٽيٽراهائيڊروبائيوپٽيرين (BH4) جي بلاڪڊ ٽي سيلز جي واڌ کي نقصان پهچائي سگهي ٿي، ۽ جسم ۾ BH4 جو اضافو CD4 ۽ CD8 جي وچ ۾ اينٽي ٽيومر مدافعتي ردعمل کي وڌائي سگهي ٿو. ان کان علاوه، ڪائنورينائن جي مدافعتي اثر کي BH4 جي انتظاميه ذريعي بچايو وڃي ٿو (5). آئسوڪيٽريٽ ڊيهائيڊروجنيز (IDH) ميوٽنٽ گليوبلاسٽوما ۾، اينانٽيوميٽابولڪ (R)-2-هائيڊروڪسيگلوٽاريٽ (R-2-HG) جو رطوبت ٽي سيل جي چالو ٿيڻ، پکيڙ ۽ سائٽوليسس سرگرمي کي روڪي ٿو (6). تازو، اهو ڏيکاريو ويو آهي ته ميٿائلگلائيڪسل، گلائڪوليسس جو هڪ ضمني پيداوار، مائيلوائيڊ اصل جي دٻائيندڙ سيلز پاران پيدا ڪيو ويندو آهي، ۽ ميٿائلگلائيڪسل جي ٽي سيل منتقلي اثر ڪندڙ ٽي سيل جي ڪم کي روڪي سگهي ٿي. علاج ۾، ميٿائلگلائيڪسل جي غير جانبداري مائيلوائيڊ مان نڪتل دٻائيندڙ سيلز (MDSC) جي سرگرمي کي ختم ڪري سگهي ٿي ۽ ماؤس ماڊلز ۾ چيڪ پوائنٽ بلاڪڊ ٿراپي کي هم آهنگي سان وڌائي سگهي ٿي (7). اهي مطالعي مجموعي طور تي ٽي سيل جي ڪم ۽ سرگرمي کي منظم ڪرڻ ۾ TME مان نڪتل ميٽابولائٽس جي اهم ڪردار تي زور ڏين ٿا.
ٽي سيل جي خرابي کي رحم جي ڪينسر ۾ وڏي پيماني تي رپورٽ ڪيو ويو آهي (8). اهو جزوي طور تي هائپوڪسيا ۽ غير معمولي ٽيومر ويسڪوليچر (9) ۾ موجود ميٽابولڪ خاصيتن جي ڪري آهي، جنهن جي نتيجي ۾ گلوڪوز ۽ ٽرپٽوفن کي ضمني شين جهڙوڪ ليڪٽڪ ايسڊ ۽ ڪائنورينائن ۾ تبديل ڪيو ويندو آهي. اضافي ايڪسٽرا سيلولر ليڪٽيٽ انٽرفيرون-γ (IFN-γ) جي پيداوار کي گهٽائي ٿو ۽ مائيلوسوپريسيو سب گروپس جي فرق کي هلائي ٿو (10، 11). ٽرپٽوفن جو استعمال سڌو سنئون ٽي سيل جي واڌ کي روڪي ٿو ۽ ٽي سيل ريڪٽر سگنلنگ کي روڪي ٿو (12-14). انهن مشاهدن جي باوجود، مدافعتي ميٽابولزم جي چوڌاري تمام گهڻو ڪم ان ويٽرو ٽي سيل ڪلچر ۾ بهتر ميڊيا استعمال ڪندي ڪيو ويو، يا وييو ۾ هوموگلوس ماؤس ماڊل تائين محدود، جن مان ڪو به مڪمل طور تي انساني ڪينسر ۽ جسماني ميڪرو ۽ مائڪرو ماحول جي هيٽروجينيٽي کي ظاهر نٿو ڪري.
رحم جي ڪينسر جي هڪ عام خاصيت پيريٽونيل پکيڙ ۽ جلودر جو ظاهر ٿيڻ آهي. جلودر ۾ سيل فلوئڊ جو جمع ٿيڻ ترقي يافته بيماري ۽ خراب پيشنگوئي سان لاڳاپيل آهي (15). رپورٽن مطابق، هي منفرد ڪمپارٽمينٽ هائپوڪسڪ آهي، ان ۾ ويسڪولر اينڊوٿيليل گروٿ فيڪٽر (VEGF) ۽ انڊوليامين 2,3-ڊائي آڪسيجنيس (IDO) جي اعليٰ سطح آهي، ۽ ٽي ريگيوليٽري سيلز ۽ مائيلوڊ انحيبيٽري سيلز (15-18) ذريعي داخل ٿئي ٿو. جلودر جو ميٽابولڪ ماحول پاڻ ٽيومر کان مختلف ٿي سگهي ٿو، تنهن ڪري پيريٽونيل اسپيس ۾ ٽي سيلز جي ٻيهر پروگرامنگ واضح ناهي. ان کان علاوه، ٽيومر ماحول ۾ موجود جلودر ۽ ميٽابولائٽس جي وچ ۾ اهم فرق ۽ هيٽروجينيٽي مدافعتي سيلز جي دراندازي ۽ ٽيومر تي انهن جي ڪم کي روڪي سگهي ٿي، ۽ وڌيڪ تحقيق جي ضرورت آهي.
انهن مسئلن کي حل ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ حساس سيل سيپريشن ۽ مائع ڪروميٽوگرافي ٽينڊم ماس اسپيڪٽروميٽري (LC-MS/MS) طريقو ٺاهيو ته جيئن مختلف سيل قسمن (CD4 + ۽ CD8 + T سيلز سميت) جو مطالعو ڪري سگهجي ۽ ان جي وچ ۾ ٽيومر ان جا ميٽابولائٽس مريض جي ساڳئي ايسائٽس ۽ ٽيومر ماحول ۾ سيلز کي اسپين ڪن ٿا. اسان هن طريقي کي هاءِ ڊائمينشنل فلو سائيٽوميٽري ۽ سنگل سيل آر اين اي سيڪوئنسنگ (scRNA-seq) سان گڏ استعمال ڪريون ٿا ته جيئن انهن اهم آبادي جي ميٽابولڪ حيثيت جو هڪ انتهائي حل ٿيل پورٽريٽ مهيا ڪري سگهجي. هن طريقي سان ٽيومر ٽي سيلز ۾ 1-ميٿيل نيڪوٽينامائيڊ (MNA) جي سطح ۾ هڪ اهم واڌ ظاهر ٿي، ۽ ان ويٽرو تجربن مان ظاهر ٿيو ته T سيل فنڪشن تي MNA جو امونوموڊوليٽري اثر اڳ ۾ نامعلوم هو. عام طور تي، هي طريقو ٽيومر ۽ مدافعتي سيلز جي وچ ۾ باهمي ميٽابولڪ رابطي کي ظاهر ڪري ٿو، ۽ مدافعتي ضابطي ميٽابولائٽس ۾ منفرد بصيرت فراهم ڪري ٿو، جيڪو T سيل تي ٻڌل رحم جي ڪينسر جي امونوٿراپي جي علاج لاءِ ڪارآمد ٿي سگهي ٿو. علاج جا موقعا.
اسان هڪ ئي وقت گلوڪوز اپٽيڪ کي مقدار ڏيڻ لاءِ هاءِ ڊائمينشنل فلو سائيٽوميٽري استعمال ڪئي [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) هڪجهڙائي سان عام نشان آهن جيڪي مدافعتي سيلز ۽ ٽيومر سيلز جي آبادي ۾ فرق ڪن ٿا (ٽيبل S2 ۽ شڪل S1A). هن تجزيي مان ظاهر ٿيو ته ٽي سيلز جي مقابلي ۾، ايسائٽس ۽ ٽيومر سيلز ۾ گلوڪوز اپٽيڪ جي سطح وڌيڪ هوندي آهي، پر مائيٽوڪونڊريل سرگرمي ۾ ننڍا فرق هوندا آهن. ٽيومر سيلز جي سراسري گلوڪوز اپٽيڪ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ٽي سيلز جي ڀيٽ ۾ ٽي کان چار ڀيرا آهي، ۽ CD4 + T سيلز جي سراسري گلوڪوز اپٽيڪ CD8 + T سيلز جي ڀيٽ ۾ 1.2 ڀيرا آهي، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته ٽيومر انفلٽريٽنگ لمفوسائٽس (TIL) ۾ ساڳئي TME ۾ به مختلف ميٽابولڪ گهرجون آهن (شڪل 1A). ان جي ابتڙ، ٽيومر سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي CD4 + T سيلز جي برابر آهي، ۽ ٻنهي سيل قسمن جي مائيٽوڪونڊريل سرگرمي CD8 + T سيلز کان وڌيڪ آهي (شڪل 1B). عام طور تي، اهي نتيجا ميٽابولڪ سطح کي ظاهر ڪن ٿا. ٽيومر سيلز جي ميٽابولڪ سرگرمي CD4 + T سيلز کان وڌيڪ آهي، ۽ CD4 + T سيلز جي ميٽابولڪ سرگرمي CD8 + T سيلز کان وڌيڪ آهي. سيل قسمن ۾ انهن اثرات جي باوجود، CD4 + ۽ CD8 + T سيلز جي ميٽابولڪ حيثيت ۾ يا ٽيومر جي مقابلي ۾ جلودر ۾ انهن جي نسبتي تناسب ۾ ڪو به مستقل فرق ناهي (شڪل 1C). ان جي ابتڙ، CD45-سيل فريڪشن ۾، ٽيومر ۾ EpCAM+ سيلز جو تناسب جلودر جي مقابلي ۾ وڌي ويو (شڪل 1D). اسان EpCAM+ ۽ EpCAM- سيل اجزاء جي وچ ۾ هڪ واضح ميٽابولڪ فرق پڻ ڏٺو. EpCAM+ (ٽيومر) سيلز ۾ EpCAM- سيلز جي ڀيٽ ۾ گلوڪوز اپٽيڪ ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي وڌيڪ هوندي آهي، جيڪا TME ۾ ٽيومر سيلز ۾ فائبروبلاسٽ جي ميٽابولڪ سرگرمي کان تمام گهڻي هوندي آهي (شڪل 1، E ۽ F).
(الف ۽ ب) گلوڪوز اپٽيڪ جي وچين فلوروسينس شدت (MFI) (2-NBDG) (الف) ۽ CD4 + T سيلز جي مائيٽوڪونڊريل سرگرمي (مائيٽو ٽريڪر ڳاڙهو ڳاڙهو) (ب) نمائندا گراف (کاٻي) ۽ ٽيبليٽ ٿيل ڊيٽا (ساڄي)، CD8 + T سيلز ۽ EpCAM + CD45-ٽيومر سيلز جلودر ۽ ٽيومر مان. (ج) جلودر ۽ ٽيومر ۾ CD4 + ۽ CD8 + سيلز (CD3 + T سيلز جو) جو تناسب. (د) جلودر ۽ ٽيومر ۾ EpCAM + ٽيومر سيلز جو تناسب (CD45−). (اي ۽ ف) EpCAM + CD45-ٽيومر ۽ EpCAM-CD45-ميٽرڪس گلوڪوز اپٽيڪ (2-NBDG) (اي) ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي (مائيٽو ٽريڪر ڳاڙهو ڳاڙهو) (ف) نمائندا گراف (کاٻي) ۽ ٽيبليٽ ٿيل ڊيٽا (ساڄي) جلودر ۽ ٽيومر سيلز. (ج) وهڪري سائٽوميٽري ذريعي CD25، CD137 ۽ PD1 اظهار جا نمائندا گراف. (H ۽ I) CD25، CD137 ۽ PD1 اظهار CD4 + T سيلز (H) ۽ CD8 + T سيلز (I) تي. (J ۽ K) بيوقوفي، مرڪزي ياداشت (Tcm)، اثر ڪندڙ (Teff) ۽ اثر ڪندڙ ياداشت (Tem) فينوٽائپس جيڪي CCR7 ۽ CD45RO جي اظهار جي بنياد تي آهن. جلو ۽ ٽامي ۾ CD4 + T سيلز (J) ۽ CD8 + T سيلز (K) جي نمائندگي ڪندڙ تصويرون (کاٻي) ۽ ٽيبلولر ڊيٽا (ساڄي). جوڙيل ٽي-ٽيسٽ (*P<0.05، **P<0.01 ۽ ***P<0.001) ذريعي طئي ٿيل P قدر. لڪير ملندڙ مريضن جي نمائندگي ڪري ٿي (n = 6). FMO، فلوروسينس مائنس ون؛ MFI، وچين فلوروسينس شدت.
وڌيڪ تجزيو انتهائي حل ٿيل ٽي سيل فينوٽائپڪ حيثيت جي وچ ۾ ٻيا اهم فرق ظاهر ڪيا. ٽيومر ۾ چالو ٿيل (شڪل 1، G کان I) ۽ اثر ڪندڙ ياداشت (شڪل 1، J ۽ K) ايسائٽس (CD3 + T سيلز جو تناسب) جي ڀيٽ ۾ تمام گهڻو بار بار آهن. ساڳئي طرح، ايڪٽيويشن مارڪرز (CD25 ۽ CD137) ۽ ڊيپليشن مارڪرز [پروگرام ٿيل سيل ڊيٿ پروٽين 1 (PD1)] جي اظهار ذريعي فينوٽائپ جو تجزيو ڪرڻ سان اهو ظاهر ٿيو ته جيتوڻيڪ انهن آبادي جي ميٽابولڪ خاصيتون مختلف آهن (شڪل S1، B کان E)، پر ڪو به اهم ميٽابولڪ فرق مسلسل طور تي معصوم، اثر ڪندڙ يا ياداشت جي ذيلي سيٽس (شڪل S1، F کان I) جي وچ ۾ نه ڏٺو ويو. انهن نتيجن جي تصديق مشين لرننگ طريقن کي استعمال ڪندي ڪئي وئي ته جيئن سيل فينوٽائپس (21) کي خودڪار طريقي سان تفويض ڪيو وڃي، جنهن وڌيڪ مريض جي ايسائٽس (شڪل S2A) ۾ وڏي تعداد ۾ بون ميرو سيلز (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) جي موجودگي کي ظاهر ڪيو. سڀني سڃاڻپ ٿيل سيل قسمن مان، هن مائيلوڊ سيل آبادي سڀ کان وڌيڪ گلوڪوز اپٽيڪ ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي ڏيکاري (شڪل S2، B کان G). اهي نتيجا HGSC مريضن ۾ ايسائٽس ۽ ٽيومر ۾ ملندڙ ڪيترن ئي سيل قسمن جي وچ ۾ مضبوط ميٽابولڪ فرق کي اجاگر ڪن ٿا.
TIL جي ميٽابونومڪ خاصيتن کي سمجهڻ ۾ مکيه چئلينج اهو آهي ته ٽيومر مان ڪافي پاڪائي، معيار ۽ مقدار جي ٽي سيل نمونن کي الڳ ڪرڻ جي ضرورت آهي. تازين مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته فلو سائٽوميٽري جي بنياد تي ترتيب ڏيڻ ۽ موتي جي افزودگي جا طريقا سيلولر ميٽابولائٽ پروفائلز ۾ تبديليون آڻي سگهن ٿا (22-24). هن مسئلي کي حل ڪرڻ لاءِ، اسان LC-MS/MS پاران تجزيو ڪرڻ کان اڳ سرجري طور تي ريزيڪٽ ٿيل انساني رحم جي ڪينسر مان TIL کي الڳ ڪرڻ ۽ الڳ ڪرڻ لاءِ موتي جي افزودگي جي طريقي کي بهتر بڻايو (مواد ۽ طريقا ڏسو؛ شڪل 2A). ميٽابولائٽ تبديلين تي هن پروٽوڪول جي مجموعي اثر جو جائزو وٺڻ لاءِ، اسان مٿي ڏنل موتي جي علحدگي واري مرحلي کان پوءِ صحتمند عطيو ڏيندڙن پاران چالو ڪيل ٽي سيلز جي ميٽابولائٽ پروفائلز جو مقابلو انهن سيلز سان ڪيو جيڪي موتي کان الڳ نه هئا پر برف تي رهيا. هن معيار جي ڪنٽرول تجزيي مان معلوم ٿيو ته انهن ٻن حالتن جي وچ ۾ هڪ اعلي تعلق آهي (r = 0.77)، ۽ 86 ميٽابولائٽس جي گروپ جي ٽيڪنيڪل ورجائي جي صلاحيت اعلي ورجائي جي صلاحيت آهي (شڪل 2B). تنهن ڪري، اهي طريقا سيل قسم جي افزودگي مان گذرندڙ سيلز ۾ صحيح ميٽابولائٽ تجزيو ڪري سگهن ٿا، اهڙي طرح HGSC ۾ مخصوص ميٽابولائٽس جي سڃاڻپ لاءِ پهريون اعليٰ ريزوليوشن پليٽ فارم مهيا ڪن ٿا، انهي ڪري ماڻهن کي سيل جي خاصيت جي گهري سمجھ حاصل ڪرڻ جي قابل بڻائي ٿو. جنسي ميٽابولزم پروگرام.
(الف) مقناطيسي مالا جي افزودگي جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام. LC-MS/MS پاران تجزيو ڪرڻ کان اڳ، سيلز مقناطيسي مالا جي افزودگي جا ٽي لڳاتار دور ڪندا يا برف تي رهندا. (ب) ميٽابولائٽس جي ڪثرت تي افزودگي جي قسم جو اثر. هر افزودگي جي قسم ± SE لاءِ ٽن ماپن جو سراسري. گرين لائن 1:1 تعلق جي نمائندگي ڪري ٿي. محور ليبل ۾ ڏيکاريل بار بار ماپن جو انٽرا ڪلاس لاڳاپو (ICC). NAD، نيڪوٽينامائيڊ ايڊينائن ڊائنوڪيولٽائيڊ. (ج) مريض ميٽابولائٽ تجزيي جي ڪم جي وهڪري جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام. ايسائٽس يا ٽيومر مريضن کان گڏ ڪيا ويا آهن ۽ ڪرائوپريزرڊ ڪيا ويا آهن. هر نموني جو هڪ ننڍڙو حصو فلو سائٽوميٽري ذريعي تجزيو ڪيو ويو، جڏهن ته باقي نمونن CD4+، CD8+ ۽ CD45- سيلز لاءِ افزودگي جا ٽي دور ڪيا ويا. انهن سيل حصن جو تجزيو LC-MS/MS استعمال ڪندي ڪيو ويو. (ڊي) معياري ميٽابولائٽ ڪثرت جو گرمي نقشو. ڊينڊروگرام نمونن جي وچ ۾ يوڪليڊين فاصلن جي وارڊ جي ڪلسٽرنگ جي نمائندگي ڪري ٿو. (اي) نموني ميٽابولائٽ نقشي جو پرنسپل جزو تجزيو (پي سي اي)، هر نموني جا ٽي نقل ڏيکاريندي، ساڳئي مريض جا نمونا هڪ ​​لڪير سان ڳنڍيل آهن. (ايف) مريض تي شرط ڪيل نموني جي ميٽابولائٽ پروفائل جو پي سي اي (يعني، جزوي ريڊنڊنسي استعمال ڪندي)؛ نموني جو قسم محدب هول طرفان محدود آهي. PC1، مکيه جزو 1؛ PC2، مکيه جزو 2.
اڳيون، اسان ڇهن HGSC مريضن جي پرائمري ايسائٽس ۽ ٽيومر ۾ CD4 +، CD8 + ۽ CD45-سيل فريڪشن ۾ 99 ميٽابولائٽس جو تجزيو ڪرڻ لاءِ هن افزودگي جو طريقو لاڳو ڪيو (شڪل 2C، شڪل S3A ۽ ٽيبل S3 ۽ S4). دلچسپي جي آبادي اصل وڏي نموني جي جاندار سيلز جي 2٪ کان 70٪ تائين آهي، ۽ سيلز جو تناسب مريضن جي وچ ۾ تمام گهڻو مختلف آهي. موتي کي الڳ ڪرڻ کان پوءِ، دلچسپي جي افزودگي وارو حصو (CD4+، CD8+ يا CD45-) سراسري طور تي نموني ۾ سڀني جاندار سيلز جي 85٪ کان وڌيڪ آهي. هي افزودگي جو طريقو اسان کي انساني ٽيومر ٽشو ميٽابولزم مان سيل آبادي جو تجزيو ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿو، جيڪو وڏن نمونن مان ڪرڻ ناممڪن آهي. هن پروٽوڪول کي استعمال ڪندي، اسان اهو طئي ڪيو ته l-kynurenine ۽ adenosine، اهي ٻه سٺي نموني وارا مدافعتي دٻاءُ وارا ميٽابولائٽس ٽيومر ٽي سيلز يا ٽيومر سيلز ۾ بلند ڪيا ويا هئا (شڪل S3، B ۽ C). تنهن ڪري، اهي نتيجا اسان جي سيل علحدگي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري ٽيڪنالاجي جي وفاداري ۽ صلاحيت کي ظاهر ڪن ٿا ته جيئن مريض جي بافتن ۾ حياتياتي طور تي اهم ميٽابولائٽس ڳولي سگهجن.
اسان جي تجزيي ۾ مريضن جي اندر ۽ وچ ۾ سيل جي قسمن جي مضبوط ميٽابولڪ علحدگي پڻ ظاهر ڪئي وئي (شڪل 2D ۽ شڪل S4A). خاص طور تي، ٻين مريضن جي مقابلي ۾، مريض 70 مختلف ميٽابولڪ خاصيتون ڏيکاريون (شڪل 2E ۽ شڪل S4B)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته مريضن جي وچ ۾ اهم ميٽابولڪ هيٽروجينيٽي ٿي سگهي ٿي. اهو نوٽ ڪرڻ جي قابل آهي ته ٻين مريضن جي مقابلي ۾ (1.2 کان 2 ليٽر؛ ٽيبل S1)، مريض 70 (80 ml) ۾ گڏ ڪيل ايسائٽس جي ڪل مقدار گهٽ هئي. پرنسپل جزو جي تجزيي دوران بين مريض هيٽروجينيٽي جو ڪنٽرول (مثال طور، جزوي ريڊنڊنسي تجزيو استعمال ڪندي) سيل جي قسمن جي وچ ۾ مسلسل تبديليون ڏيکاري ٿو، ۽ سيل جي قسمن ۽/يا مائڪرو ماحول کي واضح طور تي ميٽابولائٽ پروفائل جي مطابق گڏ ڪيو ويو آهي (شڪل 2F). سنگل ميٽابولائٽس جي تجزيي انهن اثرات تي زور ڏنو ۽ سيل جي قسمن ۽ مائڪرو ماحول جي وچ ۾ اهم فرق ظاهر ڪيو. اهو قابل ذڪر آهي ته سڀ کان وڌيڪ انتهائي فرق جيڪو ڏٺو ويو آهي اهو MNA آهي، جيڪو عام طور تي CD45- سيلز ۽ CD4+ ۽ CD8+ سيلز ۾ افزوده ٿيندو آهي جيڪي ٽيومر ۾ داخل ٿين ٿا (شڪل 3A). CD4 + سيلز لاءِ، هي اثر سڀ کان وڌيڪ واضح آهي، ۽ CD8 + سيلز ۾ MNA پڻ ماحول کان سخت متاثر ٿيندي نظر اچي ٿو. بهرحال، اهو اهم ناهي، ڇاڪاڻ ته ڇهن مريضن مان صرف ٽن کي ٽيومر CD8+ اسڪور لاءِ جائزو وٺي سگهجي ٿو. MNA کان علاوه، مختلف قسمن جي سيلز ۾ ايسائيٽس ۽ ٽيومر ۾، ٻيا ميٽابولائٽس جيڪي TIL ۾ خراب طور تي نمايان آهن اهي پڻ مختلف طور تي امير آهن (شڪل S3 ۽ S4). تنهن ڪري، اهي ڊيٽا وڌيڪ تحقيق لاءِ امونومودوليٽري ميٽابولائٽس جو هڪ واعدو ڪندڙ سيٽ ظاهر ڪن ٿا.
(الف) ايسائٽس ۽ ٽيومر مان CD4+، CD8+ ۽ CD45- سيلز ۾ MNA جو نارمل ڪيل مواد. باڪس پلاٽ وچين (لائن)، انٽرڪوارٽائل رينج (فريم هينگ) ۽ ڊيٽا رينج ڏيکاري ٿو، انٽرڪوارٽائل رينج (فريم ويسڪر) کان 1.5 ڀيرا تائين. جيئن مريض مواد ۽ طريقن ۾ بيان ڪيو ويو آهي، مريض جي ليما ويليو کي P ويليو (*P<0.05 ۽ **P<0.01) کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪريو. (ب) MNA ميٽابولزم جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام (60). ميٽابولائٽس: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. اينزائمز (سائي): اين اين ايم ٽي، نڪوٽينامائيڊ اين-ميٿائل ٽرانسفريز؛ ايس آءِ آر ٽي، سرٽيونز؛ اين اي ايم پي ٽي، نڪوٽينامائيڊ فاسفوريبوسائل ٽرانسفريز؛ اي او ايڪس 1، الڊي هائيڊ آڪسيڊيس 1؛ اين آر ڪي، نڪوٽينامائيڊ رائبوسائيڊ ڪائنس؛ اين ايم اين اي ٽي، نڪوٽينامائيڊ مونو نيوڪليوٽيڊ ايڊينائيليٽ ٽرانسفريز؛ پي اين پي 1، پيورين نيوڪليوسائيڊ فاسفوريليز. (سي) ايسائيٽس (گرين) ۽ ٽيومر (ڳاڙهو؛ اين = 3 مريض) جي ايس سي آر اين اي-سيڪ جو ٽي-ايس اين اي. (ڊي) ايس سي آر اين اي-سيڪ استعمال ڪندي سڃاڻپ ڪيل مختلف سيل آبادي ۾ اين اين ايم ٽي اظهار. (اي) ايس ڪي-او وي-3، انساني جنين گردي (ايڇ اي ڪي) 293 ٽي، ٽي سيلز ۽ ايم اين اي-علاج ٿيل ٽي سيلز ۾ اين اين ايم ٽي ۽ اي او ايڪس 1 جو اظهار. فولڊ ٿيل اظهار ايس ڪي-او وي-3 جي نسبت سان ڏيکاريو ويو آهي. ايس اي ايم سان اظهار جو نمونو ڏيکاريو ويو آهي (اين = 6 صحتمند عطيو ڏيندڙ). 35 کان وڌيڪ Ct قدرن کي اڻ سڃاڻڻ لائق سمجهيو ويندو آهي (UD). (F) SK-OV-3، HEK293T، T سيلز ۽ 8mM MNA سان علاج ڪيل T سيلز ۾ SLC22A1 ۽ SLC22A2 جو اظهار. فولڊ ٿيل اظهار SK-OV-3 جي نسبت سان ڏيکاريو ويو آهي. SEM سان اظهار جو نمونو ڏيکاريو ويو آهي (n = 6 صحتمند عطيو ڏيندڙ). 35 کان وڌيڪ Ct قدرن کي اڻ سڃاڻڻ لائق سمجهيو ويندو آهي (UD). (G) MNA سان 72 ڪلاڪن جي انڪيوبيشن کان پوءِ چالو ٿيل صحتمند عطيو ڪندڙ T سيلز ۾ سيل MNA مواد. SEM سان اظهار جو نمونو ڏيکاريو ويو آهي (n = 4 صحتمند عطيو ڏيندڙ).
MNA، S-adenosyl-1-methionine (SAM) کان nicotinamide (NA) ۾ nicotinamide N-methyltransferase (NNMT؛ شڪل 3B) ذريعي methyl گروپ کي منتقل ڪندي پيدا ڪيو ويندو آهي. NNMT مختلف انساني ڪينسر ۾ وڌيڪ ظاهر ٿئي ٿو ۽ ان جو تعلق پکيڙ، حملي ۽ ميٽاسٽيسس سان آهي (25-27). TME ۾ T سيلز ۾ MNA جي ماخذ کي بهتر سمجهڻ لاءِ، اسان ٽن HGSC مريضن جي ascites ۽ tumors ۾ سيل جي قسمن ۾ NNMT جي اظهار کي نمايان ڪرڻ لاءِ scRNA-seq استعمال ڪيو (ٽيبل S5). تقريبن 6,500 سيلز جي تجزيي مان ظاهر ٿيو ته ascites ۽ tumor ماحول ۾، NNMT اظهار فرض ڪيل فائبروبلاسٽ ۽ tumor سيل آبادي تائين محدود هو (شڪل 3، C ۽ D). اهو قابل ذڪر آهي ته ڪنهن به آبادي ۾ ڪو به واضح NNMT اظهار ناهي جيڪو PTPRC (CD45 +) (شڪل 3D ۽ شڪل S5A) جو اظهار ڪري ٿو، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته ميٽابولائٽ اسپيڪٽرم ۾ معلوم ڪيل MNA کي T سيلز ۾ متعارف ڪرايو ويو آهي. الڊيهائيڊ آڪسائيڊس 1 (AOX1) جو اظهار MNA کي 1-ميٿائل-2-پيريڊون-5-ڪاربوڪسامائيڊ (2-PYR) يا 1-ميٿائل-4-پيريڊون-5-ڪاربوڪسامائيڊ (4- PYR) ۾ تبديل ڪري ٿو؛ شڪل 3B) پڻ COL1A1 (شڪل S5A) کي ظاهر ڪندڙ فائبروبلاسٽ جي آبادي تائين محدود آهي، جيڪي گڏجي ظاهر ڪن ٿا ته ٽي سيلز ۾ روايتي MNA ميٽابولزم جي صلاحيت جي کوٽ آهي. انهن MNA سان لاڳاپيل جينز جي اظهار جي نموني کي HGSC مريضن جي ايسائٽس مان ٻئي آزاد سيل ڊيٽا سيٽ استعمال ڪندي تصديق ڪئي وئي (شڪل S5B؛ n = 6) (16). ان کان علاوه، MNA سان علاج ڪيل صحتمند ڊونر ٽي سيلز جي مقداري پوليمريز چين ري ايڪشن (qPCR) تجزيي مان ظاهر ٿيو ته ڪنٽرول SK-OV-3 اوورين ٽيومر سيلز جي مقابلي ۾، NNMT يا AOX1 تقريبن ظاهر نه ڪيو ويو (شڪل 3E). اهي غير متوقع نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته MNA فائبروبلاسٽس يا ٽيومر مان TME ۾ ويجهن ٽي سيلز ۾ لڪي سگهي ٿو.
جيتوڻيڪ اميدوارن ۾ نامياتي ڪيشن ٽرانسپورٽرز 1 کان 3 (OCT1، OCT2 ۽ OCT3) جو خاندان شامل آهي جيڪو حل ٿيندڙ ڪيريئر 22 (SLC22) خاندان (SLC22A1، SLC22A2 ۽ SLC22A3) پاران انڪوڊ ڪيو ويو آهي، MNA جا امڪاني ٽرانسپورٽر اڃا تائين غير واضح آهن (28). صحتمند ڊونر ٽي سيلز مان mRNA جي QPCR SLC22A1 جي گهٽ اظهار جي سطح ڏيکاري پر SLC22A2 جي اڻ ڏٺل سطح، جنهن تصديق ڪئي ته اهو اڳ ۾ ادب ۾ رپورٽ ڪيو ويو هو (شڪل 3F) (29). ان جي ابتڙ، SK-OV-3 اوورين ٽيومر سيل لائن ٻنهي ٽرانسپورٽرز جي اعلي سطحن جو اظهار ڪيو (شڪل 3F).
ٽي سيلز جي پرڏيهي ايم اين اي جذب ڪرڻ جي صلاحيت جي امڪان کي جانچڻ لاءِ، صحتمند ڊونر ٽي سيلز کي ايم اين اي جي مختلف ڪنسنٽريشن جي موجودگي ۾ 72 ڪلاڪن تائين ڪلچر ڪيو ويو. ايڪسوجينس ايم اين اي جي غير موجودگي ۾، ايم اين اي جي سيلولر مواد کي ڳولي نه ٿو سگهجي (شڪل 3G). جڏهن ته، ايڪسوجينس ايم اين اي سان علاج ڪيل چالو ٽي سيلز سيلز ۾ ايم اين اي مواد ۾ خوراک تي منحصر واڌ ڏيکاري، 6 ايم ايم ايم ايم اين اي تائين (شڪل 3G). هي نتيجو ظاهر ڪري ٿو ته ٽرانسپورٽر اظهار جي گهٽ سطح ۽ اندروني سيلولر ايم اين اي ميٽابولزم لاءِ ذميوار مکيه اينزائم جي کوٽ جي باوجود، ٽي آءِ ايل اڃا تائين ايم اين اي وٺي سگهي ٿو.
مريضن جي ٽي سيلز ۽ ان ويٽرو ايم اين اي جذب تجربن ۾ ميٽابولائٽس جو اسپيڪٽرم اهو امڪان وڌائي ٿو ته ڪينسر سان لاڳاپيل فائبروبلاسٽ (CAF) MNA کي خارج ڪن ٿا ۽ ٽيومر سيلز TIL جي فينوٽائپ ۽ ڪم کي منظم ڪري سگهن ٿا. ٽي سيلز تي MNA جي اثر کي طئي ڪرڻ لاءِ، MNA جي موجودگي يا غير موجودگي ۾ صحتمند ڊونر ٽي سيلز کي ويٽرو ۾ چالو ڪيو ويو، ۽ انهن جي واڌ ۽ سائيٽوڪائن جي پيداوار جو جائزو ورتو ويو. سڀ کان وڌيڪ دوز تي MNA شامل ڪرڻ جي 7 ڏينهن کان پوءِ، آبادي ٻيڻي ٿيڻ جو تعداد معتدل طور تي گهٽجي ويو، جڏهن ته سڀني دوائن تي جوش برقرار رکيو ويو (شڪل 4A). ان کان علاوه، خارجي MNA جي علاج جي نتيجي ۾ CD4 + ۽ CD8 + T سيلز جي تناسب ۾ اضافو ٿيو جيڪي ٽيومر نڪروسس فيڪٽر-α (TNFα؛ شڪل 4B) کي ظاهر ڪن ٿا. ان جي ابتڙ، IFN-γ جي اندروني پيداوار CD4 + T سيلز ۾ خاص طور تي گهٽجي وئي، پر CD8 + T سيلز ۾ نه، ۽ انٽرليوڪن 2 ۾ ڪا خاص تبديلي نه آئي (IL-2؛ شڪل 4، C ۽ D). تنهن ڪري، انهن MNA-علاج ٿيل T سيل ڪلچرن مان سپرنيٽنٽ جي اينزائم-لنڪڊ اميونوسوربينٽ ايسي (ELISA) TNFα ۾ اهم واڌ، IFN-γ ۾ گهٽتائي، ۽ IL-2 ۾ ڪا به تبديلي نه ڏيکاري (شڪل 4، E کان G). . IFN-γ جي گهٽتائي ظاهر ڪري ٿي ته MNA شايد T سيلز جي اينٽي ٽيومر سرگرمي کي روڪڻ ۾ ڪردار ادا ڪري سگهي ٿي. T سيل-ميڊئيٽيڊ سائيٽوٽوڪسيسيٽي تي MNA جي اثر کي نقل ڪرڻ لاءِ، گرين فلوروسينٽ پروٽين (GFP) -CAR-T) سيلز پاران منظم ڪيل فوليٽ ريڪٽر α ۽ CAR-T (GFP) کي نشانو بڻائڻ وارا chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) سيلز صحتمند ڊونر پيري فيرل بلڊ مونونيوڪليئر سيلز (PBMC) پاران پيدا ڪيا ويندا آهن. CAR-T سيلز کي MNA جي موجودگي ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ ڪلچر ڪيو ويو، ۽ پوءِ انساني SK-OV-3 اوورين ٽيومر سيلز سان گڏ ڪلچر ڪيو ويو جيڪي 10:1 جي اثر ڪندڙ کان ٽارگيٽ تناسب تي فوليٽ ريڪٽر α کي ظاهر ڪن ٿا. MNA علاج جي نتيجي ۾ FRα-CAR-T سيلز جي قتل جي سرگرمي ۾ هڪ اهم گهٽتائي آئي، جيڪا ايڊينوسين سان علاج ڪيل FRα-CAR-T سيلز وانگر هئي (شڪل 4H).
(الف) ڪل قابل عمل سيل ڳڻپ ۽ آبادي ٻيڻي ٿيڻ (PD) سڌو سنئون ڪلچر کان ڏينهن 7 ​​تي. بار گراف ڇهن صحتمند عطيو ڏيندڙن جي اوسط + SEM جي نمائندگي ڪري ٿو. گهٽ ۾ گهٽ n = 3 آزاد تجربن مان ڊيٽا جي نمائندگي ڪري ٿو. (B کان D) CD3/CD28 ۽ IL-2 کي 7 ڏينهن تائين انهن جي لاڳاپيل MNA ڪنسنٽريشن تي T سيلز کي چالو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. تجزيو ڪرڻ کان اڳ، سيلز کي PMA/ionomycin سان GolgiStop سان 4 ڪلاڪن لاءِ متحرڪ ڪيو ويو. T سيلز ۾ TNFα (B) اظهار. مثال تصوير (کاٻي) ۽ ٽيبلر ڊيٽا (ساڄي) زنده سيلز ۾ TNFα اظهار جي. IFN-γ (C) ۽ IL-2 (D) اظهار T سيلز ۾. سائيٽوڪائنز جو اظهار فلو سائيٽوميٽري ذريعي ماپيو ويو. بار گراف اوسط (n = 6 صحتمند عطيو ڏيندڙ) + SEM جي نمائندگي ڪري ٿو. P قدر کي طئي ڪرڻ لاءِ ويرينس ۽ بار بار ماپن (*P<0.05 ۽ **P<0.01) جو هڪ طرفو تجزيو استعمال ڪريو. گهٽ ۾ گهٽ n = 3 آزاد تجربن مان ڊيٽا جي نمائندگي ڪري ٿو. (E کان G) CD3/CD28 ۽ IL-2 کي 7 ڏينهن تائين انهن جي لاڳاپيل MNA ڪنسنٽريشن تي ٽي سيلز کي چالو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. وچولي کي PMA/ionomycin stimulation جي 4 ڪلاڪن کان اڳ ۽ بعد ۾ گڏ ڪيو ويو. TNFα (E)، IFN-γ (F) ۽ IL-2 (G) جي ڪنسنٽريشن ELISA ذريعي ماپي وئي. بار گراف اوسط (n = 5 صحتمند ڊونرز) + SEM جي نمائندگي ڪري ٿو. P قدر ويرينس ۽ بار بار ماپن جي هڪ طرفي تجزيي (*P<0.05) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو. ڊاٽ ٿيل لائن سڃاڻپ جي حد کي ظاهر ڪري ٿي. (H) سيل ليسس ايسي. FRα-CAR-T يا GFP-CAR-T سيلز کي 24 ڪلاڪن لاءِ ايڊينوسين (250μM) يا MNA (10 mM) سان ترتيب ڏنو ويو، يا علاج نه ڪيو ويو (Ctrl). SK-OV-3 سيلز جي سيڪڙو مارڻ جي ماپ ڪئي وئي. P قدر ويلچ ٽي ٽيسٽ (*P<0.5 ۽ **P<0.01) ذريعي طئي ڪيو ويو.
MNA تي منحصر TNFα اظهار جي ضابطي جي ميڪانياتي سمجھ حاصل ڪرڻ لاءِ، MNA-علاج ٿيل T سيلز جي TNFα mRNA ۾ تبديلين جو جائزو ورتو ويو (شڪل 5A). MNA سان علاج ڪيل صحتمند ڊونر ٽي سيلز TNFα ٽرانسڪرپشن جي سطحن ۾ ٻه ڀيرا واڌ ڏيکاري، اهو ظاهر ڪري ٿو ته MNA TNFα ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن تي منحصر آهي. هن ممڪن ريگيوليٽري ميڪانيزم جي جاچ ڪرڻ لاءِ، ٻه ڄاتل سڃاتل ٽرانسڪرپشن فيڪٽر جيڪي TNFα کي منظم ڪن ٿا، يعني چالو ٿيل T سيل نيوڪليئر فيڪٽر (NFAT) ۽ مخصوص پروٽين 1 (Sp1)، جو جائزو MNA کي پروڪسمل TNFα پروموٽر (30) سان ڳنڍڻ جي جواب ۾ ڪيو ويو. TNFα پروموٽر ۾ 6 سڃاڻپ ٿيل NFAT بائنڊنگ سائيٽون ۽ 2 Sp1 بائنڊنگ سائيٽون شامل آهن، هڪ سائيٽ تي اوورليپ ڪندي [-55 بيس جوڙا (bp) 5'cap کان] (30). ڪروميٽِن امونوپريسيپٽيشن (ChIP) ڏيکاريو ته جڏهن MNA سان علاج ڪيو ويو، ته TNFα پروموٽر سان Sp1 جو پابند ٽي ڀيرا وڌي ويو. NFAT جي شموليت پڻ وڌي وئي ۽ اهميت جي ويجهو آئي (شڪل 5B). هي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته MNA Sp1 ٽرانسڪرپشن ذريعي TNFα جي اظهار کي منظم ڪري ٿو، ۽ گهٽ حد تائين NFAT جي اظهار کي.
(الف) MNA کان سواءِ ڪلچر ڪيل T سيلز جي مقابلي ۾، MNA سان علاج ڪيل T سيلز ۾ TNFα اظهار جي فولڊ تبديلي. SEM سان اظهار جو نمونو ڏيکاريو ويو آهي (n = 5 صحتمند عطيو ڏيندڙ). گهٽ ۾ گهٽ n = 3 آزاد تجربن مان ڊيٽا جي نمائندگي ڪري ٿو. (ب) NFAT ۽ Sp1 کان پوءِ 8 mM MNA سان يا ان کان سواءِ علاج ڪيل T سيلز جي TNFα پروموٽر کي 4 ڪلاڪن لاءِ (Ctrl) ۽ PMA/ionomycin stimulation سان گڏ ڪيو ويو. امونوگلوبلين G (IgG) ۽ H3 کي ترتيب وار مدافعتي سيلز ۾ TNFα پروموٽر سان منفي ۽ مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. ChIP جي مقدار جي تشخيص ڏيکاري ٿي ته MNA-علاج ٿيل سيلز ۾ TNFα پروموٽر سان Sp1 ۽ NFAT جو پابند ڪنٽرول جي مقابلي ۾ ڪيترائي ڀيرا وڌي ويو. گهٽ ۾ گهٽ n = 3 آزاد تجربن مان ڊيٽا جي نمائندگي ڪري ٿو. ڪيترن ئي ٽي-ٽيسٽن (*** P <0.01) پاران طئي ڪيل P قدر. (ج) HGSC جي ايسائٽس جي مقابلي ۾، T سيلز (غير سائيٽوٽوڪسڪ) ٽيومر ۾ TNF جي وڌندڙ اظهار کي ڏيکاريو. رنگ مختلف مريضن جي نمائندگي ڪن ٿا. ڏيکاريل سيلز کي بي ترتيب نموني 300 تائين ڪيو ويو آهي ۽ اوور ڊرائنگ کي محدود ڪرڻ لاءِ جِٽر ڪيو ويو آهي (** Padj = 0.0076). (D) رحم جي ڪينسر لاءِ MNA جو تجويز ڪيل ماڊل. MNA TME ۾ ٽيومر سيلز ۽ فائبروبلاسٽ ۾ پيدا ٿئي ٿو ۽ T سيلز پاران ورتو ويندو آهي. MNA TNFα پروموٽر سان Sp1 جي پابند کي وڌائي ٿو، جنهن جي ڪري TNFα ٽرانسڪرپشن ۽ TNFα سائيٽوڪائن جي پيداوار ۾ اضافو ٿئي ٿو. MNA پڻ IFN-γ ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجي ٿو. T سيل جي ڪم جي روڪٿام قتل جي صلاحيت کي گهٽائي ٿي ۽ ٽيومر جي واڌ کي تيز ڪري ٿي.
رپورٽن مطابق، TNFα ۾ اڳيان ۽ پوئتي تي منحصر اينٽي ٽيومر ۽ اينٽي ٽيومر اثرات آهن، پر ان جو رحم جي ڪينسر جي واڌ ۽ ميٽاسٽيسس کي فروغ ڏيڻ ۾ هڪ مشهور ڪردار آهي (31-33). رپورٽن مطابق، رحم جي ڪينسر جي مريضن ۾ ايسائيٽس ۽ ٽيومر ٽشوز ۾ TNFα جو ڪنسنٽريشن بينائن ٽشوز (34-36) کان وڌيڪ آهي. ميڪانيزم جي لحاظ کان، TNFα اڇي رت جي سيلز جي چالو ڪرڻ، ڪم ۽ واڌ کي منظم ڪري سگهي ٿو، ۽ ڪينسر جي سيلز جي فينوٽائپ کي تبديل ڪري سگهي ٿو (37، 38). انهن نتيجن سان مطابقت رکندڙ، ڊفرنشل جين ايڪسپريشن تجزيي مان ظاهر ٿيو ته TNF ايسائيٽس جي مقابلي ۾ ٽيومر ٽشوز ۾ ٽي سيلز ۾ خاص طور تي اپ-ريگوليٽ ڪيو ويو (شڪل 5C). TNF جي اظهار ۾ اضافو صرف ٽي سيل آبادي ۾ غير سائٽوٽوڪسڪ فينوٽائپ (شڪل S5A) سان واضح هو. خلاصو، اهي ڊيٽا ان خيال جي حمايت ڪن ٿا ته MNA وٽ HGSC ۾ ٻٽي امونوسوپريسيو ۽ ٽيومر کي فروغ ڏيڻ وارا اثر آهن.
فلو سائٽوميٽري تي ٻڌل فلوروسينٽ ليبلنگ TIL ميٽابولزم جي مطالعي لاءِ مکيه طريقو بڻجي چڪو آهي. انهن مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته ثانوي لففائيڊ عضون مان پردي جي رت جي لففوسائٽس يا ٽي سيلز جي مقابلي ۾، مورين ۽ انساني TIL ۾ گلوڪوز کي کڻڻ جو رجحان وڌيڪ آهي (4، 39) ۽ مائيٽوڪونڊريل فنڪشن جو بتدريج نقصان (19، 40). جيتوڻيڪ اسان هن مطالعي ۾ ساڳيا نتيجا ڏٺا آهن، اهم ترقي ساڳي ريسيڪٽيڊ ٽيومر ٽشو مان ٽيومر سيلز ۽ TIL جي ميٽابولزم جو مقابلو ڪرڻ آهي. انهن پوئين ڪجهه رپورٽن سان مطابقت رکندڙ، ايسائيٽس ۽ ٽيومر مان ٽيومر (CD45-EpCAM +) سيلز ۾ CD8 + ۽ CD4 + T سيلز جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ گلوڪوز اپٽيڪ آهي، انهي جي حمايت ڪندي ته ٽيومر سيلز جي اعلي گلوڪوز اپٽيڪ کي T سيلز سان مقابلو ڪري سگهجي ٿو. ٽي سيل مقابلي جو تصور. TME. بهرحال، ٽيومر سيلز جي مائيٽوڪونڊريل سرگرمي CD8 + T سيلز جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ آهي، پر مائيٽوڪونڊريل سرگرمي CD4 + T سيلز جي برابر آهي. اهي نتيجا ابھرندڙ موضوع کي مضبوط ڪن ٿا ته آڪسائيڊيوٽ ميٽابولزم ٽيومر سيلز لاءِ اهم آهي (41، 42). اهي اهو به تجويز ڪن ٿا ته CD8 + T سيلز CD4 + T سيلز جي ڀيٽ ۾ آڪسائيڊيوٽو ڊسڪشن لاءِ وڌيڪ حساس ٿي سگهن ٿا، يا اهو ته CD4 + T سيلز گلوڪوز کان سواءِ ڪاربن ذريعن کي استعمال ڪري سگهن ٿا ته جيئن مائيٽوڪونڊريل سرگرمي برقرار رکي سگهجي (43، 44). اهو ياد رکڻ گهرجي ته اسان جلو ۾ CD4 + T اثر ڪندڙ، T اثر ڪندڙ ياداشت ۽ T مرڪزي ياداشت جي سيلز جي وچ ۾ گلوڪوز اپٽيڪ يا مائيٽوڪونڊريل سرگرمي ۾ ڪو به فرق نه ڏٺو. ساڳئي طرح، ٽيومر ۾ CD8 + T سيلز جي فرق جي حالت جو گلوڪوز اپٽيڪ ۾ تبديلين سان ڪو به تعلق ناهي، جيڪو ان ويٽرو ۾ ڪلچر ٿيل ٽي سيلز ۽ انساني TIL ان ويوو (22) جي وچ ۾ اهم فرق کي اجاگر ڪري ٿو. انهن مشاهدن جي تصديق غير جانبدار خودڪار سيل آبادي مختص ڪرڻ جي استعمال سان پڻ ڪئي وئي، جنهن وڌيڪ ظاهر ڪيو ته CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + سيلز جيڪي ٽيومر سيلز جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ گلوڪوز اپٽيڪ ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي سان گڏ آهن پر انهن ۾ ميٽابولڪ فعال سيل آبادي آهي. هي آبادي شايد scRNA-seq تجزيي ۾ سڃاڻپ ڪيل مائيلوئڊ سپريسر سيلز يا پلازما سائٽائيڊ ڊينڊريٽڪ سيلز جي پوٽيٽو سب آبادي جي نمائندگي ڪري سگهي ٿي. جيتوڻيڪ اهي ٻئي انساني رحم جي ٽامي ۾ رپورٽ ڪيا ويا آهن [45]، انهن کي اڃا تائين وڌيڪ ڪم جي ضرورت آهي هن مائيلوڊ ذيلي آبادي کي بيان ڪرڻ لاءِ.
جيتوڻيڪ فلو سائٽوميٽري تي ٻڌل طريقا سيل جي قسمن جي وچ ۾ گلوڪوز ۽ آڪسائيڊيوٽ ميٽابولزم ۾ عام فرق کي واضح ڪري سگهن ٿا، TME ۾ مائيٽوڪونڊريل ميٽابولزم لاءِ گلوڪوز يا ٻين ڪاربن ذريعن پاران پيدا ٿيندڙ صحيح ميٽابولائٽس اڃا تائين طئي نه ڪيا ويا آهن. ڏنل TIL سبسيٽ کي ميٽابولائٽس جي موجودگي يا غير موجودگي کي تفويض ڪرڻ لاءِ سيل جي آبادي کي ايڪسائيز ٿيل ٽشو مان صاف ڪرڻ جي ضرورت آهي. تنهن ڪري، اسان جو سيل افزودگي جو طريقو ماس اسپيڪٽروميٽري سان گڏ انهن ميٽابولائٽس ۾ بصيرت فراهم ڪري سگهي ٿو جيڪي ٽي سيلز ۽ ٽيومر سيل آبادي ۾ ملندڙ مريضن جي نمونن ۾ مختلف طور تي افزوده آهن. جيتوڻيڪ هن طريقي ۾ فلوروسينس-فعال سيل ترتيب ڏيڻ تي فائدا آهن، ڪجهه ميٽابولائٽ لائبريريون موروثي استحڪام ۽/يا تيز ٽرن اوور ريٽ جي ڪري متاثر ٿي سگهن ٿيون (22). تنهن هوندي به، اسان جو طريقو ٻن تسليم ٿيل امونوسوپريسو ميٽابولائٽس، ايڊينوسين ۽ ڪائنورينائن کي سڃاڻڻ جي قابل هو، ڇاڪاڻ ته اهي نموني جي قسمن جي وچ ۾ تمام گهڻو مختلف آهن.
اسان جي ٽيومر ۽ TIL ذيلي قسمن جو ميٽابونومڪ تجزيو بيضوي TME ۾ ميٽابولائٽس جي ڪردار بابت وڌيڪ بصيرت فراهم ڪري ٿو. پهرين، فلو سائٽوميٽري استعمال ڪندي، اسان اهو طئي ڪيو ته ٽيومر ۽ CD4 + T سيلز جي وچ ۾ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي ۾ ڪو فرق نه هو. بهرحال، LC-MS/MS تجزيي انهن آبادي ۾ ميٽابولائٽس جي گهڻائي ۾ اهم تبديليون ظاهر ڪيون، اهو ظاهر ڪري ٿو ته TIL ميٽابولزم ۽ ان جي مجموعي ميٽابولڪ سرگرمي بابت نتيجن کي محتاط تشريح جي ضرورت آهي. ٻيو، MNA ميٽابولائٽ آهي جنهن ۾ CD45-سيلز ۽ ٽي سيلز جي وچ ۾ سڀ کان وڏو فرق آهي، ٽيومر نه. تنهن ڪري، ڪمپارٽمينٽلائيزيشن ۽ ٽيومر جي جڳهه جا TIL ميٽابولزم تي مختلف اثر ٿي سگهن ٿا، جيڪو ڏنل مائڪرو ماحول ۾ ممڪن هيٽروجنيٽي کي اجاگر ڪري ٿو. ٽيون، MNA پيدا ڪندڙ اين اين ايم ٽي جو اظهار بنيادي طور تي CAF تائين محدود آهي، جيڪو گهٽ حد تائين ٽيومر سيلز آهي، پر ٽيومر مان نڪتل ٽي سيلز ۾ MNA جي سطحن جو مشاهدو ڪيو ويندو آهي. بيضوي CAF ۾ NNMT جي اوور ايڪسپريشن جو ڪينسر کي فروغ ڏيڻ وارو اثر معلوم ٿئي ٿو، جزوي طور تي CAF ميٽابولزم، ٽيومر جي حملي ۽ ميٽاسٽيسس جي واڌاري جي ڪري (27). جيتوڻيڪ TIL جي مجموعي سطح معتدل آهي، CAF ۾ NNMT جو اظهار ڪينسر جينوم اٽلس (TCGA) mesenchymal ذيلي قسم سان ويجهي سان لاڳاپيل آهي، جيڪو خراب پروگنوسس سان لاڳاپيل آهي (27، 46، 47). آخرڪار، MNA جي تباهي لاءِ ذميوار اينزائم AOX1 جو اظهار پڻ CAF آبادي تائين محدود آهي، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته T سيلز ۾ MNA کي ميٽابولائز ڪرڻ جي صلاحيت جي کوٽ آهي. اهي نتيجا هن خيال جي حمايت ڪن ٿا ته جيتوڻيڪ هن ڳولا جي تصديق ڪرڻ لاءِ وڌيڪ ڪم جي ضرورت آهي، T سيلز ۾ MNA جي اعلي سطح هڪ مدافعتي CAF مائڪرو ماحول جي موجودگي جي نشاندهي ڪري سگهي ٿي.
ايم اين اي ٽرانسپورٽرن جي گهٽ اظهار جي سطح ۽ ايم اين اي ميٽابولزم ۾ شامل اهم پروٽين جي اڻ ڏٺل سطحن کي ڏنو وڃي، ٽي سيلز ۾ ايم اين اي جي موجودگي غير متوقع آهي. نه ته اين اين ايم ٽي ۽ نه ئي اي او ايڪس 1 کي ٻن آزاد ڪوهورٽس جي scRNA-seq تجزيو ۽ ٽارگيٽ ڪيل qPCR ذريعي ڳولي سگهجي ٿو. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ايم اين اي ٽي سيلز پاران ٺهيل نه آهي، پر آس پاس جي TME مان جذب ٿئي ٿو. ان ويٽرو تجربن مان ظاهر ٿئي ٿو ته ٽي سيلز خارجي MNA گڏ ڪرڻ جو رجحان رکن ٿا.
اسان جي ان ويٽرو مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته خارجي MNA ٽي سيلز ۾ TNFα جي اظهار کي متاثر ڪري ٿو ۽ TNFα پروموٽر سان Sp1 جي پابند کي وڌائي ٿو. جيتوڻيڪ TNFα ۾ اينٽي ٽيومر ۽ اينٽي ٽيومر ٻئي ڪم آهن، اوورين ڪينسر ۾، TNFα اوورين ڪينسر جي واڌ کي فروغ ڏئي سگهي ٿو (31-33). اوورين ٽيومر سيل ڪلچر ۾ TNFα جي غير جانبداري يا مائوس ماڊلز ۾ TNFα سگنل جو خاتمو TNFα-ثالث سوزش واري سائيٽوڪائن جي پيداوار کي بهتر بڻائي سگهي ٿو ۽ ٽومر جي واڌ کي روڪي سگهي ٿو (32، 35). تنهن ڪري، هن صورت ۾، TME-نڪتل MNA آٽوڪرائن لوپ ذريعي TNFα-انحصار ميڪانيزم ذريعي پرو-انفلاميٽري ميٽابولائٽ طور ڪم ڪري سگهي ٿو، انهي ڪري اوورين ڪينسر جي موجودگي ۽ پکيڙ کي فروغ ڏئي ٿو (31). هن امڪان جي بنياد تي، TNFα بلاڪڊ کي اوورين ڪينسر لاءِ هڪ امڪاني علاج واري ايجنٽ جي طور تي مطالعو ڪيو پيو وڃي (37، 48، 49). ان کان علاوه، MNA اوورين ٽيومر سيلز ۾ CAR-T سيلز جي سائيٽوٽوڪسيسيٽي کي خراب ڪري ٿو، MNA-ثالث مدافعتي دٻاءُ لاءِ وڌيڪ ثبوت فراهم ڪري ٿو. مجموعي طور تي، اهي نتيجا هڪ ماڊل جي تجويز ڪن ٿا جنهن ۾ ٽيومر ۽ CAF سيلز MNA کي خارجي سيلولر TME ۾ خارج ڪن ٿا. (i) TNF-حوصلہ افزائي رحم جي ڪينسر جي واڌ جي محرک ۽ (ii) MNA-حوصلہ افزائي ٽي سيل سائيٽوٽوڪسڪ سرگرمي جي روڪٿام ذريعي، ان ۾ ٻٽي ٽيومر اثر ٿي سگهي ٿو (شڪل 5D).
نتيجي ۾، تيز سيل افزودگي، سنگل سيل سيڪوئنسنگ ۽ ميٽابولڪ پروفائلنگ جي ميلاپ کي لاڳو ڪندي، هن مطالعي HGSC مريضن ۾ ٽيومر ۽ ايسائٽس سيلز جي وچ ۾ وڏي اميونوميٽابولومڪ فرق کي ظاهر ڪيو. هن جامع تجزيي مان ظاهر ٿيو ته ٽي سيلز جي وچ ۾ گلوڪوز اپٽيڪ ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي ۾ فرق آهن، ۽ MNA کي هڪ غير سيل خودمختيار مدافعتي ريگيوليٽري ميٽابولائٽ جي طور تي سڃاڻپ ڪيو. انهن ڊيٽا جو اثر آهي ته TME انساني ڪينسر ۾ ٽي سيل ميٽابولزم کي ڪيئن متاثر ڪري ٿو. جيتوڻيڪ ٽي سيلز ۽ ڪينسر سيلز جي وچ ۾ غذائي اجزاء لاءِ سڌي مقابلي جي رپورٽ ڪئي وئي آهي، ميٽابولائٽس پڻ ٽيومر جي ترقي کي فروغ ڏيڻ ۽ ممڪن طور تي اندروني مدافعتي ردعمل کي دٻائڻ لاءِ اڻ سڌي ريگيوليٽر طور ڪم ڪري سگهن ٿا. انهن ريگيوليٽري ميٽابولائٽس جي فنڪشنل ڪردار جي وڌيڪ وضاحت اينٽي ٽيومر مدافعتي ردعمل کي وڌائڻ لاءِ متبادل حڪمت عمليون کولي سگهي ٿي.
مريضن جا نمونا ۽ ڪلينيڪل ڊيٽا ڪينيڊين ٽشو ريپوزٽري نيٽ ورڪ پاران تصديق ٿيل BC ڪينسر ٽيومر ٽشو ريپوزٽري ذريعي حاصل ڪيا ويا. BC ڪينسر ريسرچ ايٿڪس ڪميٽي ۽ يونيورسٽي آف برٽش ڪولمبيا (H07-00463) پاران منظور ٿيل پروٽوڪول موجب، سڀني مريضن جي نمونن ۽ ڪلينيڪل ڊيٽا باخبر تحريري رضامندي حاصل ڪئي يا رسمي طور تي انهن جي رضامندي کان دستبردار ٿي ويا. نمونا تصديق ٿيل بايو بينڪ (BRC-00290) ۾ محفوظ ڪيا ويا آهن. تفصيلي مريض جون خاصيتون ٽيبل S1 ۽ S5 ۾ ڏيکاريل آهن. cryopreservation لاءِ، هڪ اسڪيلپل استعمال ڪيو ويندو آهي ته جيئن مريض جي ٽيومر نموني کي ميڪاني طور تي ختم ڪري سگهجي ۽ پوءِ ان کي 100-مائڪرون فلٽر ذريعي هڪ سيل سسپنشن حاصل ڪرڻ لاءِ دٻايو وڃي. مريض جي ايسائٽس کي 1500 rpm تي 10 منٽن لاءِ 4°C تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ته جيئن سيلز کي پيليٽ ڪري سگهجي ۽ سپرنيٽينٽ کي هٽايو وڃي. ٽيومر ۽ جلودر مان حاصل ڪيل سيلز کي 50٪ گرمي-غير فعال انساني AB سيرم (سگما-الڊرچ)، 40٪ RPMI-1640 (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) ۽ 10٪ ڊائي ميٿائل سلفو آڪسائيڊ ۾ ڪرائوپريزرڊ ڪيو ويو. انهن محفوظ ڪيل سنگل سيل سسپنشن کي پگھلايو ويو ۽ هيٺ بيان ڪيل ميٽابولومڪس ۽ ميٽابولائٽ جي تعين لاءِ استعمال ڪيو ويو.
مڪمل وچولي ۾ 0.22 μm فلٽر ٿيل 50:50 ضميمه RPMI 1640 شامل آهن: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) 10٪ گرمي-غير فعال انساني AB سيرم (سگما-الڊرچ)، 12.5 mM هيپس (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ)، 2 mM l-glutamine (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) فشر سائنٽيفڪ)، 1 x پينسلين اسٽريپٽوميسن (پين اسٽريپ) حل (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) ۽ 50 μMB-mercaptoethanol شامل آهن. AimV (انويٽروجن) 20 mM هيپس (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) ۽ 2 mM l-glutamine (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) سان گڏ آهي. فلو سائيٽوميٽر اسٽيننگ بفر ۾ 0.22μm فلٽر ٿيل فاسفيٽ بفر ٿيل سالين (PBS؛ انويٽروجن) شامل آهن جيڪي 3٪ گرمي-غير فعال AB انساني سيرم (سگما) سان گڏ آهن. سيل افريچمينٽ بفر 0.22μm فلٽر ٿيل PBS تي مشتمل آهي ۽ 0.5٪ گرمي-غير فعال انساني AB سيرم (سگما-الڊرچ) سان گڏ آهي.
37°C مڪمل وچولي ۾، سيلز کي 10 nM MT DR ۽ 100 μM 2-NBDG سان 30 منٽن لاءِ داغ ڏنو ويو. ان کان پوءِ، سيلز کي 4°C تي 15 منٽن لاءِ وائبيليٽي ڊائي eF506 سان داغ ڏنو ويو. FC بلاڪ (eBioscience) ۽ Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ۾ سيلز کي ٻيهر معطل ڪريو، فلو سائيٽو ميٽر اسٽيننگ بفر ۾ ملايو (ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق)، ۽ ڪمري جي حرارت تي 10 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو. سيلز کي اينٽي باڊيز جي سيٽ (ٽيبل S2) سان 4°C تي فلو سائيٽو ميٽري اسٽيننگ بفر ۾ 20 منٽن لاءِ داغ ڏيو. تجزيو کان اڳ سيلز کي فلو سائيٽو ميٽري اسٽيننگ بفر (Cytek Aurora؛ 3L-16V-14B-8R ترتيب) ۾ ٻيهر معطل ڪريو. سيلز جي ڳڻپ ڊيٽا جو تجزيو ڪرڻ لاءِ SpectroFlo ۽ FlowJo V10 استعمال ڪريو، ۽ ڊيٽا ٺاهڻ لاءِ GraphPad Prism 8 استعمال ڪريو. 2-NBDG ۽ MT DR جي وچين فلوروسينس شدت (MFI) کي لاگ-نارملائيز ڪيو ويو، ۽ پوءِ ملندڙ مريضن جي حساب سان شمارياتي تجزيي لاءِ هڪ جوڙيل ٽي ٽيسٽ استعمال ڪيو ويو. تجزيي مان 40 کان گهٽ واقعن سان سڀني آبادي کي هٽايو؛ شمارياتي تجزيو ۽ ڊيٽا بصري ڪرڻ کان اڳ ڪنهن به منفي قدرن لاءِ 1 جي MFI قدر داخل ڪريو.
مٿي ڏنل پروسيس پينل جي دستي گيٽنگ حڪمت عملي کي پورو ڪرڻ لاءِ، اسان شڪل جي پابندي واري وڻ (FAUST) (21) جي مڪمل تشريح استعمال ڪئي ته جيئن FlowJo ۾ مئل سيلز کي ختم ڪرڻ کان پوءِ آبادي کي سيلز کي خودڪار طريقي سان تفويض ڪيو وڃي. اسان دستي طور تي آئوٽ پُٽ کي منظم ڪريون ٿا ته جيئن آبادي کي غلط طور تي مختص ڪيو وڃي (PD1+ کي PD1-ٽيومر سيلز سان گڏ ڪندي) ۽ برقرار رکيل آبادي کي ضم ڪيو وڃي. هر نموني ۾ ڪل 11 آبادي لاءِ سراسري طور تي 2٪ کان وڌيڪ سيلز شامل آهن.
پي بي ايم سي کي ليوڪوائيٽ سيپريشن پراڊڪٽس (STEMCELL ٽيڪنالاجيز) کان الڳ ڪرڻ لاءِ فِڪول گريڊينٽ ڊينسٽي سينٽرفيوگيشن استعمال ڪئي وئي. سي ڊي 8 + ٽي سيلز کي پي بي ايم سي کان سي ڊي 8 مائڪرو بيڊس (ملٽيني) استعمال ڪندي الڳ ڪيو ويو ۽ ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق 2 هفتن لاءِ ٽرانس ايڪٽ (ملٽيني) استعمال ڪندي مڪمل ميڊيم ۾ وڌايو ويو. سيلز کي IL-7 (10 اين جي/ايم ايل؛ پيپرو ٽيڪ) تي مشتمل مڪمل ميڊيم ۾ 5 ڏينهن تائين بيهڻ جي اجازت ڏني وئي، ۽ پوءِ ٽرانس ايڪٽ سان ٻيهر متحرڪ ڪيو ويو. 7 هين ڏينهن تي، ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق، انساني سي ڊي 45 مائڪرو بيڊس (ملٽيني) کي مسلسل ٽن رائونڊ ۾ سيلز کي افزوده ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. سيلز کي فلو سائٽوميٽري تجزيي لاءِ (جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي)، ۽ 10 لک سيلز کي LC-MS/MS تجزيي لاءِ ٽي ڀيرا الگ ڪيو ويو. نمونن کي LC-MS/MS ذريعي پروسيس ڪيو ويو جيئن هيٺ بيان ڪيو ويو آهي. اسان گم ٿيل ميٽابولائٽ قدر جو اندازو 1,000 جي آئن نمبر سان لڳايو. هر نموني کي ڪل آئن نمبر (TIC) سان نارملائيز ڪيو ويندو آهي، لاگارٿمي طور تي تبديل ڪيو ويندو آهي ۽ تجزيو کان اڳ MetaboAnalystR ۾ خودڪار طريقي سان نارملائيز ڪيو ويندو آهي.
هر مريض جي سنگل سيل سسپنشن کي پگھلايو ويو ۽ 40 μm فلٽر ذريعي مڪمل وچولي ۾ فلٽر ڪيو ويو (جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي). ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول جي مطابق، مائڪرو بيڊس (ملٽيني) استعمال ڪندي مقناطيسي بيڊ سيپريشن ذريعي مثبت چونڊ جا ٽي مسلسل دور CD8+، CD4+ ۽ CD45- سيلز (برف تي) لاءِ نمونن کي افزوده ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا. مختصر ۾، سيلز کي سيل افزودگي بفر ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو آهي (جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي) ۽ ڳڻيو ويو آهي. سيلز کي انساني CD8 موتي، انساني CD4 موتي يا انساني CD45 موتي (ملٽيني) سان 15 منٽن لاءِ 4°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ سيل افزودگي بفر سان ڌوئي ويو. نمونو LS ڪالم (ملٽيني) ذريعي گذريو ويندو آهي، ۽ مثبت ۽ منفي فرق گڏ ڪيا ويندا آهن. مدت کي گهٽائڻ ۽ سيل جي بحالي واري مرحلي کي وڌائڻ لاءِ، CD8-فرڪشن کي پوءِ CD4+ افزودگي جي ٻئي دور لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ CD4-فرڪشن کي بعد ۾ CD45-افزودگي لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. حل کي الڳ ڪرڻ جي عمل دوران برف تي رکو.
ميٽابولائٽ تجزيي لاءِ نمونا تيار ڪرڻ لاءِ، سيلز کي هڪ ڀيرو برف جي ٿڌي لوڻ جي محلول سان ڌوتو ويو، ۽ هر نموني ۾ 80٪ ميٿانول جو 1 ملي ليٽر شامل ڪيو ويو، پوءِ وورٽيڪس ڪيو ويو ۽ مائع نائٽروجن ۾ سنيپ منجمد ڪيو ويو. نمونن کي ٽن فريز-ٿائو چڪرن جي تابع ڪيو ويو ۽ 14,000 rpm تي 4 ° C تي 15 منٽن لاءِ سينٽريفيوج ڪيو ويو. ميٽابولائٽس تي مشتمل سپرنيٽينٽ سڪي وڃڻ تائين بخارات بڻجي ويندو آهي. ميٽابولائٽس کي 0.03٪ فارمڪ ايسڊ جي 50 μl ۾ ٻيهر حل ڪيو ويو، ملائڻ لاءِ وورٽيڪس ڪيو ويو، ۽ پوءِ ملبہ هٽائڻ لاءِ سينٽريفيوج ڪيو ويو.
مٿي بيان ڪيل طور تي ميٽابولائٽس ڪڍو. ميٽابولومڪس ريسرچ لاءِ سپرنيٽينٽ کي هڪ اعليٰ ڪارڪردگي واري مائع ڪروميٽوگرافي بوتل ۾ منتقل ڪريو. بيچ اثرات کي روڪڻ لاءِ هر نموني کي ساڳئي تعداد ۾ سيلز سان علاج ڪرڻ لاءِ هڪ بي ترتيب علاج پروٽوڪول استعمال ڪريو. اسان AB SCIEX QTRAP 5500 ٽرپل ڪواڊروپول ماس اسپيڪٽروميٽر (50) تي اڳ شايع ٿيل عالمي ميٽابولائٽس جو هڪ معيار جو جائزو ورتو. ڪروميٽوگرافڪ تجزيو ۽ چوٽي واري علائقي جو انضمام ملٽي ڪوانٽ ورزن 2.1 سافٽ ويئر (اپلائيڊ بايو سسٽم SCIEX) استعمال ڪندي ڪيو ويو.
گم ٿيل ميٽابولائٽ جي قدر جو اندازو لڳائڻ لاءِ 1000 جو آئن ڳڻپ استعمال ڪيو ويو، ۽ هر نموني جو TIC هر معلوم ٿيل ميٽابولائٽ جي نارملائيزڊ چوٽي واري علائقي کي ڳڻڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو ته جيئن نموني پروسيسنگ مان اوزارن جي تجزيي ذريعي متعارف ڪرايل تبديلين کي درست ڪري سگهجي. TIC کي نارملائيز ڪرڻ کان پوءِ، MetaboAnalystR(51) (ڊفالٽ پيرا ميٽر) لاگارٿمڪ ڪنورشن ۽ خودڪار نارم لائن اسڪيلنگ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. اسان نموني جي قسمن جي وچ ۾ ميٽابولوم فرقن جي ڳولااتي تجزيو ڪرڻ لاءِ ويگن آر پيڪيج سان PCA استعمال ڪيو، ۽ مريضن جو تجزيو ڪرڻ لاءِ جزوي ريڊنڊنسي تجزيو استعمال ڪيو. نمونن جي وچ ۾ يوڪليڊين فاصلي کي ڪلسٽر ڪرڻ لاءِ گرمي نقشي ڊينڊروگرام ٺاهڻ لاءِ وارڊ طريقو استعمال ڪريو. اسان معياري ميٽابولائٽ جي گهڻائي تي ليما (52) استعمال ڪيو ته جيئن پوري سيل جي قسم ۽ مائڪرو ماحول ۾ مختلف مقدار ۾ ميٽابولائٽس جي سڃاڻپ ڪري سگهجي. وضاحت کي آسان بڻائڻ لاءِ، اسان ماڊل کي بيان ڪرڻ لاءِ گروپ مين پيرا ميٽر استعمال ڪندا آهيون، ۽ مائڪرو ماحول ۾ سيل جي قسمن کي هر گروپ (n = 6 گروپ) طور سمجهيو ويندو آهي؛ اهميت جي جاچ لاءِ، اسان هر ميٽابولائٽ لاءِ ٽي بار بار ماپون ڪيون. غلط نقل کان بچڻ لاءِ، مريض کي ليما ڊيزائن ۾ رڪاوٽ جي طور تي شامل ڪيو ويو. مختلف مريضن جي وچ ۾ ميٽابولائٽس ۾ فرق کي جانچڻ لاءِ، اسان ليما ماڊل کي مقرر طريقي سان مريضن سميت ترتيب ڏنو. اسان سيل جي قسم ۽ پڊج <0.05 (بينجاميني-هچبرگ اصلاح) جي مائڪرو ماحول جي وچ ۾ اڳ ۾ بيان ڪيل تضاد جي اهميت جي رپورٽ ڪريون ٿا.
ملٽيني ڊيڊ سيل ريموول ڪٽ (> 80٪ حياتياتي) استعمال ڪندي طاقت جي افزودگي کان پوءِ، 10x 5′جين ايڪسپريشن پروٽوڪول استعمال ڪندي ڪل زنده منجمد جلودر ۽ ٽيومر نمونن تي سنگل سيل ٽرانسڪرپٽوم سيڪوئنسنگ ڪئي وئي. ملندڙ ٽامي ۽ جلودر سان پنج ڪيسن جو تجزيو ڪيو ويو، جيتوڻيڪ هڪ ٽامي نموني مان گهٽ حياتياتي ان جي شموليت کي روڪيو. مريضن جي ڪيترن ئي چونڊن کي حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان 10x ڪروميم ڪنٽرولر جي لين ۾ هر مريض جي نمونن کي گڏ ڪيو، ۽ جلودر ۽ ٽيومر سائيٽن جو الڳ الڳ تجزيو ڪيو. تسلسل کان پوءِ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp پيئرڊ اينڊ (PE)، ڪيوبيڪ جينوم؛ سراسري طور تي ٽيومر ۽ ايسائٽس لاءِ هر سيل ۾ 73,488 ۽ 41,378 ريڊز آهن]]، اسان سيل ايس اين پي ۽ ويريو (53) استعمال ڪيو (سيل ايس اين پي جي بنياد تي جيئن GRCh38 پاران مهيا ڪيل عام انساني ايس اين پي (VCF) کي ڊونر جي سڃاڻپ تفويض ڪئي وئي آهي. اسان مريض جي جينوٽائپ اسٽيٽس (IBS) جي ويجهي سڃاڻپ (IBS) جو اندازو لڳائڻ لاءِ SNPRelate استعمال ڪندا آهيون، غير تفويض ڪيل سيلز ۽ سيلز کي ڇڏي جيڪي ڊپليڪس طور سڃاڻپ ڪيا ويا آهن ۽ ايسائٽس ۽ ٽيومر جي نمونن جي وچ ۾ ڊونرز کي ملائي رهيا آهن (54). هن ڪم جي بنياد تي، اسان هيٺئين وهڪري جي تجزيي لاءِ ٽيومر ۽ ايسائٽس ۾ گهڻي مقدار ۾ سيل نمائندگي سان ٽي ڪيس برقرار رکيا. اسڪيٽر (55) ۽ اسڪران (56) بايو ڪنڊڪٽر پيڪنگنگ ۾ ماس فلٽريشن قدم انجام ڏيڻ کان پوءِ، ان تجزيي لاءِ 6975 سيلز (ٽيومر ۽ ايسائٽس مان ترتيب وار 2792 ۽ 4183 سيلز) حاصل ڪيا. اسان شيئر ٿيل ويجهي پاڙيسري نيٽ ورڪ (SNN) جي igraph's (57) Louvain ڪلسٽرنگ استعمال ڪندا آهيون. اظهار جي لحاظ کان ڪلسٽر سيلز تائين جي ڪارڊ جو فاصلو. ڪلسٽرز کي دستي طور تي مارڪر جين اظهار جي بنياد تي پوٽيٽو سيل قسمن ۾ تشريح ڪئي وئي ۽ ٽي-ايس اين اي سان تصور ڪيو ويو. سائيٽوٽوڪسڪ ٽي سيلز CD8A ۽ GZMA جي اظهار سان بيان ڪيا ويا آهن، گهٽ رائبوسومل پروٽين اظهار سان ذيلي ڪلسٽرز کي ڇڏي. اسان ايزار ۽ ٻين جي شايع ٿيل ڊيٽا تائين رسائي حاصل ڪئي. (16)، انهن جي ٽي-ايس اين اي ايمبيڊنگ سميت، مدافعتي سيل مارڪرز ۽ اين اين ايم ٽي اظهار جي وچ ۾ اظهار اوورليپ کي ڪنٽرول ڪري سگهي ٿو.
PBMC کي Ficoll gradient density centrifugation ذريعي ليوڪوائيٽ سيپريشن پراڊڪٽس (STEMCELL ٽيڪنالاجيز) کان الڳ ڪيو ويو. CD3 + سيلز کي CD3 بيڊز (Miltenyi) استعمال ڪندي PBMC کان الڳ ڪيو ويو. MNA جي موجودگي يا غير موجودگي ۾، CD3+ سيلز کي پليٽ-بائونڊ CD3 (5μg/ml)، حل ٿيندڙ CD28 (3μg/ml) ۽ IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) سان چالو ڪيو ويو. توسيع جي آخري ڏينهن تي، قابل عمل (Fixable Viability Dye eFluor450، eBioscience) ۽ proliferation (123count eBeads، Thermo Fisher Scientific) جو جائزو فلو سائٽوميٽري ذريعي ورتو ويو. 4 ڪلاڪن تائين GolgiStop سان PMA (20 ng/ml) ۽ ionomycin (1μg/ml) سان سيلز کي متحرڪ ڪندي اثر ڪندڙ ڪم جو جائزو وٺو، ۽ CD8-PerCP (RPA-T8، BioLegend)، CD4-AF700 (RPA-T4)، BioLegend) ۽ TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11، BD) جي نگراني ڪريو. 4 ڪلاڪن تائين PMA (20 ng/ml) ۽ ionomycin (1μg/ml) سان qPCR ۽ ChIP سيلز کي متحرڪ ڪريو. ELISA سپرنٽينٽ 4 ڪلاڪن تائين PMA (20 ng/ml) ۽ ionomycin (1 μg/ml) سان محرک کان اڳ ۽ بعد ۾ گڏ ڪيو ويو.
آر اين ايزي پلس ميني ڪٽ (QIAGEN) استعمال ڪندي آر اين اي کي الڳ ڪرڻ لاءِ ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول تي عمل ڪريو. نموني کي هم جنس ڪرڻ لاءِ QIAshredder (QIAGEN) استعمال ڪريو. مڪمل ڊي اين اي (cDNA) کي سنٿيسائيز ڪرڻ لاءِ سي ڊي اين اي ڪٽ (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) ۾ اعليٰ گنجائش وارو آر اين اي استعمال ڪريو. هيٺ ڏنل پروبس سان جين ايڪسپريشن (ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول جي مطابق) کي مقدار ڏيڻ لاءِ ٽاڪ مين ريپڊ ايڊوانسڊ ماسٽر مڪس (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪريو: Hs00196287_m1 (NNMT)، Hs00154079_m1 (AOX1)، Hs00427552_m1 (SLC22A1)، Hs02786624_g1 [گليسرالڊيهائيڊ-3-فاسفيٽ آف هائيڊروجن (GAPDH)] ۽ Hs01010726_m1 (SLC22A2). نمونا StepOnePlus ريئل ٽائيم PCR سسٽم (اپلائيڊ بايو سسٽم) (اپلائيڊ بايو سسٽم) تي مائڪرو ايمپ فاسٽ آپٽيڪل 96-ويل ري ايڪشن پليٽ (اپلائيڊ بايو سسٽم) ۾ مائڪرو ايمپ آپٽيڪل فلم سان هلايا ويا. ڪو به Ct ويليو جيڪو 35 کان وڌيڪ آهي ان کي ڳولڻ جي حد کان مٿي سمجهيو ويندو آهي ۽ ان کي ناقابلِ سڃاڻپ طور نشان لڳايو ويندو آهي.
اڳ ۾ بيان ڪيل طور تي ChIP انجام ڏيو (58). مختصر ۾، سيلز کي فارملڊيهائيڊ (آخري ڪنسنٽريشن 1.42٪) سان علاج ڪيو ويو ۽ 10 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. 10 منٽن لاءِ برف تي اضافي سوجن بفر (25 ايم ايم هيپس، 1.5 ايم ايم ايم ايم جي سي ايل 2، 10 ايم ايم ڪي سي ايل ۽ 0.1٪ اين پي-40) استعمال ڪريو، پوءِ بيان ڪيل طور تي امونوپريسيپيشن بفر ۾ ٻيهر معطل ڪريو (58). پوءِ نموني کي هيٺين چڪرن سان سونيڪٽ ڪيو ويو: 10 چڪر (20 1 سيڪنڊ پلس) ۽ 40 سيڪنڊن جو جامد وقت. ChIP-گريڊ امونوگلوبلين G (سيل سگنلنگ ٽيڪنالاجي؛ 1μl)، هسٽون H3 (سيل سگنلنگ ٽيڪنالاجي؛ 3μl)، NFAT (انويٽروجن؛ 3μl) ۽ SP1 (سيل سگنلنگ ٽيڪنالاجي؛ 3μl) اينٽي باڊيز کي 4°CC تي رات جو نموني سان انڪيوبيٽ ڪريو. پروٽين A بيڊز (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) کي نموني سان 4°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ هلڪي ڇڪڻ سان انڪيوبيٽ ڪريو، پوءِ ڊي اين اي کي افزوده ڪرڻ لاءِ چيليڪس بيڊز (بايو-ريڊ) استعمال ڪريو، ۽ پروٽين جي هضم لاءِ پروٽينيس K (ٿرمو فشر) استعمال ڪريو. TNFα پروموٽر کي PCR پاران معلوم ڪيو ويو: فارورڊ، GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ ان جي برعڪس، GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp پراڊڪٽ). تصويرون اميج ليب (بايو-ريڊ) پاران تيار ڪيون ويون ۽ اميج جي سافٽ ويئر استعمال ڪندي مقدار مقرر ڪئي وئي.
سيل ڪلچر سپرنيٽينٽ مٿي بيان ڪيل طريقي سان گڏ ڪيو ويو. اهو تعين ٺاهيندڙ جي انساني TNFα ELISA ڪٽ (انويٽروجن)، انساني IL-2 ELISA ڪٽ (انويٽروجن) ۽ انساني IFN-γ ELISA ڪٽ (Abcam) جي طريقيڪار مطابق ڪيو ويو. ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول موجب، سپرنيٽينٽ کي TNFα ۽ IL-2 کي ڳولڻ لاءِ 1:100 ۽ IFN-γ کي ڳولڻ لاءِ 1:3 سان ملايو ويو. 450 nm تي جذب کي ماپڻ لاءِ EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) استعمال ڪريو.
PBMC کي Ficoll gradient density centrifugation ذريعي ليوڪوائيٽ سيپريشن پراڊڪٽس (STEMCELL ٽيڪنالاجيز) کان الڳ ڪيو ويو. CD3 + سيلز کي CD3 بيڊز (Miltenyi) استعمال ڪندي PBMC کان الڳ ڪيو ويو. MNA جي موجودگي يا غير موجودگي ۾، CD3+ سيلز کي پليٽ-بائونڊ CD3 (5μg/ml)، حل ٿيندڙ CD28 (3μg/ml) ۽ IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) سان 3 ڏينهن تائين چالو ڪيو ويو. 3 ڏينهن کان پوءِ، سيلز کي گڏ ڪيو ويو ۽ 0.9٪ لوڻ سان ڌويو ويو، ۽ پيلٽ کي سنيپ منجمد ڪيو ويو. سيلز جي ڳڻپ 123count eBeads استعمال ڪندي فلو سائيٽوميٽري (Cytek Aurora؛ 3L-16V-14B-8R ترتيب) ذريعي ڪئي وئي.
مٿي بيان ڪيل ميٽابولائٽس ڪڍو. خشڪ ڪڍڻ کي 4000 سيل برابر/μl جي ڪنسنٽريشن تي ٻيهر ٺاهيو ويو. نموني جو تجزيو ريورسڊ فيز ڪروميٽوگرافي (1290 انفينٽي II، ايجيلنٽ ٽيڪنالاجيز، سانتا ڪلارا، CA) ۽ CORTECS T3 ڪالم (2.1×150 ملي ميٽر، پارٽيڪل سائيز 1.6-μm، پور سائيز 120-Å؛ #186008500، واٽر) ذريعي ڪيو ويو. پولر ماس اسپيڪٽروميٽر (6470، ايجيلنٽ)، جنهن ۾ اليڪٽرو اسپري آئنائيزيشن مثبت موڊ ۾ ڪم ڪري ٿو. موبائل مرحلو A 0.1٪ فارمڪ ايسڊ آهي (H2O ۾)، موبائل مرحلو B 90٪ ايسٽونائيٽريل آهي، 0.1٪ فارمڪ ايسڊ آهي. LC گريڊينٽ 100% A لاءِ 0 کان 2 منٽ، 99% B لاءِ 2 کان 7.1 منٽ، ۽ 99% B لاءِ 7.1 کان 8 منٽ آهي. پوءِ ڪالم کي موبائل فيز A سان 0.6 ml/min جي وهڪري جي شرح تي 3 منٽن لاءِ ٻيهر متوازن ڪريو. . وهڪري جي شرح 0.4ml/min آهي، ۽ ڪالم چيمبر کي 50°C تائين گرم ڪيو ويندو آهي. برقرار رکڻ جو وقت (RT) ۽ تبديلي قائم ڪرڻ لاءِ MNA جي خالص ڪيميائي معيار (M320995، ٽورنٽو ريسرچ ڪيميڪل ڪمپني، نارٿ يارڪ، اونٽاريو، ڪينيڊا) استعمال ڪريو (RT = 0.882 منٽ، تبديلي 1 = 137→94.1، تبديلي 2 = 137→92، تبديلي 3 = 137→78). جڏهن سڀئي ٽي منتقلي صحيح برقرار رکڻ جي وقت تي ٿينديون آهن، منتقلي 1 کي مخصوصيت کي يقيني بڻائڻ لاءِ مقدار جي تصديق لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. MNA (ٽورنٽو ريسرچ ڪيميڪل ڪمپني) جو معياري وکر اسٽاڪ محلول (1 mg/ml) جي ڇهن سيريل ڊائليشنز ذريعي پيدا ڪيو ويو ته جيئن 0.1، 1.0، 10 ۽ 100 ng/ml ۽ 1.0 ۽ 10μg/ml جي معيار کي ترتيب وار مائع حاصل ڪري سگهجي. ڳولڻ جي حد 1 ng/ml آهي، ۽ لڪير جواب 10 ng/ml ۽ 10μg/ml جي وچ ۾ آهي. نموني ۽ معيار جي ٻن مائڪروليٽرن جي هر انجيڪشن کي LC/MS تجزيي لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ تجزيو پليٽ فارم جي استحڪام کي يقيني بڻائڻ لاءِ هر اٺ انجيڪشن تي هڪ مخلوط معيار ڪنٽرول نمونو هلايو ويندو آهي. سڀني MNA-علاج ٿيل سيل نمونن جا MNA جواب امتحان جي لڪير جي حد اندر هئا. ڊيٽا تجزيو MassHunter مقداري تجزيو سافٽ ويئر (v9.0، Agilent) استعمال ڪندي ڪيو ويو.
ٻئي نسل جي αFR-CAR تعمير Song et al. (59) مان ورتي وئي هئي. مختصر ۾، تعمير ۾ هيٺ ڏنل مواد شامل آهن: CD8a ليڊر تسلسل، انساني αFR-مخصوص سنگل چين متغير ٽڪرو، CD8a هينگ ۽ ٽرانس ميمبرين علائقو، CD27 انٽرا سيلولر ڊومين ۽ CD3z انٽرا سيلولر ڊومين. مڪمل CAR تسلسل کي GenScript پاران سنٿيسائز ڪيو ويو، ۽ پوءِ ٽرانسڊڪشن ڪارڪردگي جو جائزو وٺڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ GFP ايڪسپريشن ڪيسٽ جي ٻئي نسل جي لينٽي وائرل ايڪسپريشن ویکٹر اپ اسٽريم ۾ ڪلون ڪيو ويو.
لينٽيو وائرس HEK293T سيلز [آمريڪي ٽائيپ ڪلچر ڪليڪشن (ATCC) جي ٽرانسفيڪشن ذريعي پيدا ٿئي ٿو؛ ڊولبيڪو جي تبديل ٿيل ايگل ميڊيم ۾ پوکيو ويندو آهي جنهن ۾ 10٪ فيٽل بووائن سيرم (FBS) ۽ 1٪ پين اسٽريپ شامل آهن، ۽ CAR-GFP ویکٹر استعمال ڪيو ويندو آهي ۽ پيڪنگنگ پلازميڊ (psPAX2 ۽ pMD2.G، ايڊجين) لپوفڪشن امائن (سگما-الڊرچ) استعمال ڪندا آهن. وائرس تي مشتمل سپرنيٽينٽ ٽرانسفيڪشن کان 48 ۽ 72 ڪلاڪن بعد گڏ ڪيو ويو، فلٽر ڪيو ويو، ۽ الٽرا سينٽريفيوگيشن ذريعي مرڪوز ڪيو ويو. مرڪوز وائرل سپرنيٽينٽ کي -80 ° C تي ٽرانسڊڪشن تائين ذخيرو ڪريو.
PBMC کي صحتمند ڊونر ليوڪوائيٽ سيپريشن پراڊڪٽس (STEMCELL ٽيڪنالاجيز) کان Ficoll گريڊينٽ ڊينسٽي سينٽرفيوگيشن ذريعي الڳ ڪيو ويو آهي. PBMC کان CD8+ سيلز کي الڳ ڪرڻ لاءِ مثبت چونڊ CD8 مائڪروبيڊس (Miltenyi) استعمال ڪريو. TransAct (Miltenyi) سان ۽ TexMACS ميڊيم ۾ T سيلز کي متحرڪ ڪريو [Miltenyi؛ 3٪ گرمي-غير فعال انساني سيرم، 1٪ PenStrep ۽ IL-2 (300 U/ml) سان گڏ]. محرک کان چوويهه ڪلاڪ پوءِ، T سيلز کي لينٽي وائرس (10 μl مرڪوز وائرس سپرنيٽينٽ في 106 سيلز) سان منتقل ڪيو ويو. Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter)، Singlet، GFP+ تي منتقلي کان 1 کان 3 ڏينهن بعد، گهٽ ۾ گهٽ 30٪ جي منتقلي ڪارڪردگي کي ظاهر ڪرڻ لاءِ سيلز جي GFP اظهار جو جائزو وٺو.
CAR-T سيلز کي 24 ڪلاڪن لاءِ اميونوڪولٽ (STEMCELL ٽيڪنالاجيز؛ 1٪ پين اسٽريپ سان گڏ) ۾ هيٺين حالتن هيٺ ڪلچر ڪيو ويو: علاج نه ڪيو ويو، 250 μM ايڊينوسين يا 10 ايم ايم ايم اين اي سان علاج ڪيو ويو. پريٽريٽمينٽ کان پوءِ، CAR-T سيلز کي PBS سان ڌوئي ويو ۽ 20,000 SK-OV-3 سيلز سان ملايو ويو [ATCC؛ ميڪ ڪوئي 5A ميڊيم (سگما-الڊريچ) ۾ 10٪ FBS ۽ 1٪ پين اسٽريپ سان گڏ 10 تي: 1 جي اثر ڪندڙ کي ٽارگيٽ تناسب کي ضم ٿيل اميونوڪولٽ ميڊيم ۾ ٽرپليڪيٽ ۾ وڌايو ويو. SK-OV-3 سيلز ۽ SK-OV-3 سيلز کي ڊجيٽلس سيپونن (0.5mg/ml؛ سگما-الڊريچ) سان ليس ڪيو ويو، ترتيب وار منفي ۽ مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. 24 ڪلاڪن جي گڏيل پوک کان پوءِ، سپرنيٽينٽ گڏ ڪيو ويو ۽ ليڪٽيٽ ڊيهائيڊروجنيز (LDH) کي ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق ماپيو ويو (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit، Promega). LDH سپرنيٽينٽ کي LDH بفر ۾ 1:50 تي ملائي ڇڏيو ويو. قتل جو سيڪڙو هيٺ ڏنل فارمولا استعمال ڪندي ماپيو ويو: قتل جو سيڪڙو = اصلاح جو سيڪڙو / وڌ ۾ وڌ قتل جي شرح x 100٪، جتي اصلاح جو سيڪڙو = صرف گڏيل ڪلچر-ٽي سيلز، ۽ وڌ ۾ وڌ قتل جي شرح = مثبت ڪنٽرول-منفي ڪنٽرول.
جيئن متن يا مواد ۽ طريقن ۾ بيان ڪيو ويو آهي، شمارياتي تجزيي لاءِ گراف پيڊ پرزم 8، مائڪروسافٽ ايڪسل يا آر وي 3.6.0 استعمال ڪريو. جيڪڏهن هڪ ئي مريض کان ڪيترائي نمونا گڏ ڪيا وڃن (جهڙوڪ ايسائٽس ۽ ٽيومر)، اسان هڪ جوڙيل ٽي ٽيسٽ استعمال ڪندا آهيون يا مريض کي هڪ لڪير يا عام ماڊل ۾ بي ترتيب اثر جي طور تي شامل ڪندا آهيون جيئن مناسب هجي. ميٽابولومڪس تجزيي لاءِ، اهميت جو امتحان ٽن نقلن ۾ ڪيو ويندو آهي.
هن مضمون لاءِ اضافي مواد لاءِ، مهرباني ڪري ڏسو http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
هي هڪ کليل رسائي وارو مضمون آهي جيڪو ڪريٽو ڪامنز انتساب-غير-ڪمرشل لائسنس جي شرطن تحت ورهايو ويو آهي، جيڪو ڪنهن به وچولي ۾ استعمال، ورڇ ۽ ٻيهر پيداوار جي اجازت ڏئي ٿو، جيستائين آخري استعمال تجارتي فائدي لاءِ نه هجي ۽ بنياد اهو هجي ته اصل ڪم صحيح آهي. حوالو.
نوٽ: اسان توهان کي صرف پنهنجو اي ميل پتو ڏيڻ لاءِ چئون ٿا ته جيئن توهان جنهن شخص کي صفحي تي سفارش ڪري رهيا آهيو اهو ڄاڻي ته توهان چاهيو ٿا ته اهي اي ميل ڏسن ۽ اهو اسپام نه آهي. اسان ڪو به اي ميل پتو نه پڪڙينداسين.
هي سوال جانچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته ڇا توهان هڪ مهمان آهيو ۽ خودڪار اسپام جمع ڪرائڻ کي روڪڻ لاءِ.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour)، Sarah MacPherson (Sarah MacPherson)، Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias)، Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson)، John Stagg (John Stagg)، Brad H. Nelson (Brad H. N. J. R. Bellard) ڊي برارڊينس)، رسل جي. جونز (رسل جي. جونز)، فيناس ٽي. هئملٽن (فيناس ٽي.
ايم اين اي ٽي سيلز جي مدافعتي دٻاءُ ۾ حصو وٺندو آهي ۽ انساني ڪينسر جي علاج لاءِ هڪ امڪاني اميونوٿراپي هدف جي نمائندگي ڪري ٿو.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour)، Sarah MacPherson (Sarah MacPherson)، Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias)، Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson)، John Stagg (John Stagg)، Brad H. Nelson (Brad H. N. J. R. Bellard) ڊي برارڊينس)، رسل جي. جونز (رسل جي. جونز)، فيناس ٽي. هئملٽن (فيناس ٽي.
ايم اين اي ٽي سيلز جي مدافعتي دٻاءُ ۾ حصو وٺندو آهي ۽ انساني ڪينسر جي علاج لاءِ هڪ امڪاني اميونوٿراپي هدف جي نمائندگي ڪري ٿو.
©2021 آمريڪن ايسوسيئيشن فار دي ايڊوانسمينٽ آف سائنس. سڀ حق محفوظ آهن. AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef ۽ COUNTER جو شريڪ آھي. سائنس ايڊوانسز ISSN 2375-2548.