Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جيڪو برائوزر ورجن استعمال ڪري رهيا آهيو ان ۾ CSS لاءِ محدود سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو). ساڳئي وقت، مسلسل سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ ڏيکارينداسين.
ڪرنگهي وارن جانورن جي برعڪس، حشرات کي وڏي پيماني تي نر-متعصب جنسي اسٽيرائيڊ هارمونز جي کوٽ سمجهيو ويندو آهي. اينوفيلس گيمبي ​​۾، ايڪڊيسون اسٽيرائيڊ 20-هائيڊروڪسي ايڪڊيسون (20E) مادي 2 پاران ٺهيل ٿيڻ تي بيضي جي ترقي کي ڪنٽرول ڪرڻ ۽ نر 3 پاران جنسي طور تي منتقل ٿيڻ تي ميٽنگ ريفريڪٽري دور کي پيدا ڪرڻ لاءِ ارتقا پذير ٿيو آهي. جيئن ته آنڊن جي ترقي ۽ ميلاپ ضروري پيداواري خاصيتون آهن، اهو سمجهڻ ته مادي اينوفيلس مڇر انهن هارمونل سگنلن کي ڪيئن ضم ڪن ٿا، نئين مليريا ڪنٽرول پروگرامن جي ڊيزائن کي آسان بڻائي سگهي ٿو. هتي، اسان ظاهر ڪريون ٿا ته اهي پيدائشي ڪم ايڪڊيسٽرائيڊ-فعال / غير فعال اينزائمز جي هڪ پيچيده نيٽ ورڪ ذريعي مختلف جنسي اسٽيرائيڊز ذريعي منظم ڪيا ويندا آهن. اسان هڪ نر-مخصوص آڪسائيڊ ٿيل ايڪڊيسون، 3-ڊيهائيڊرو-20E (3D20E) جي سڃاڻپ ڪئي، جيڪا جنسي منتقلي ۽ ڊيفاسفوريليشن ذريعي چالو ٿيڻ کان پوءِ عورتن جي جنسي قبوليت کي بند ڪندي والدين جي حفاظت ڪري ٿي. قابل ذڪر طور تي، 3D20E منتقلي پڻ پيدائشي جين جي اظهار کي متاثر ڪيو جيڪي پلازموڊيم انفيڪشن دوران بيضي جي ترقي کي برقرار رکندا آهن، متاثر ٿيل عورتن جي صحت کي يقيني بڻائيندا آهن. عورت مان نڪتل 20E جنسي ردعمل پيدا نٿو ڪري، پر 20E-روڪندڙ ڪائناسز جي روڪٿام کان پوءِ ملن وارن فردن کي آنا ڏيڻ جي اجازت ڏئي ٿو. هن نر مخصوص ڪيڙن جي اسٽيرائيڊ هارمون جي سڃاڻپ ۽ عورتن جي جنسي قبوليت، زرخيزي ۽ پلازموڊيم سان رابطي کي منظم ڪرڻ ۾ ان جو ڪردار مليريا منتقل ڪندڙ مڇرن جي پيدائشي ڪاميابي کي گهٽائڻ جي صلاحيت کي ظاهر ڪري ٿو.
انساني مليريا جي پيراسائٽس جو واحد ویکٹر اينوفيليس مڇرن ۾ وڏي پيماني تي جراثيم ڪش مزاحمت جي ڪري مليريا جا ڪيس ۽ موت ٻيهر وڌي رهيا آهن. انهن مڇرن جي ميلاپ جي حياتيات نئين مليريا ڪنٽرول مداخلتن لاءِ خاص طور تي پرڪشش هدف آهي ڇاڪاڻ ته ماديون صرف هڪ ڀيرو ملن ٿيون5؛ هن واحد ميلاپ جي واقعي کي جراثيم کان پاڪ بڻائڻ سان ميدان ۾ مڇرن جي آبادي کي گهٽائڻ جي وڏي صلاحيت هوندي.
مردن کان هاءِ ٽائيٽر اسٽيرائيڊ هارمون حاصل ڪرڻ کان پوءِ عورتون جنسي طور تي معذور ٿي وينديون آهن. مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته وڌيڪ ميلاپ ۾ ڏکيائي جو سبب 20-هائيڊروڪسيڪڊيسون (20E) آهي، هڪ اسٽيرائيڊ هارمون جيڪو لاروا اسٽيج ۾ پگھلڻ واري چڪر جي ريگيوليٽر طور سڃاتو وڃي ٿو. نر جي 20E کي سنٿيسائيز ڪرڻ ۽ منتقل ڪرڻ جي صلاحيت خاص طور تي اينوفيليس نسلن ۾ ترقي ڪئي آهي جيڪي سبجينس سيليا 7 جو حصو آهن، جيڪو آفريڪا ۾ ورهايل آهي ۽ ان ۾ مليريا جا سڀ کان خطرناڪ ویکٹر شامل آهن، جن ۾ اينوفيليس گيمبيا شامل آهن. اهو خاص طور تي قابل ذڪر آهي ڇاڪاڻ ته انهن نسلن ۾ عورتون هر رت جي ماني کان پوءِ 20E پيدا ڪن ٿيون، ۽ 20E اوجينيسس چڪر کي هلائي ٿو (ريفري 8 ڏسو). بهرحال، ان طريقي بابت ٿورو ئي ڄاڻ آهي ته عورتون ايڪڊيسون جي ٻن مختلف ذريعن (مرد جي منتقلي ۽ رت جي ماني جي انڊڪشن) مان سگنلن کي ڪيئن ضم ڪن ٿيون بغير انهن جي پنهنجي ميلاپ جي صلاحيت سان سمجهوتو ڪرڻ جي. حقيقت ۾، جيڪڏهن عورتن پاران پيدا ڪيل 20E جنسي عدم برداشت کي متحرڪ ڪري ٿو، ته اهو ڪنوار کي کارائڻ وارن فردن ۾ بانجھ پن جو سبب بڻجندو، انهن ۾ هڪ تمام عام رويو. مڇر 5.
هڪ ممڪن وضاحت اها آهي ته A. gambiae نر هڪ تبديل ٿيل نر مخصوص ايڪڊيسون منتقل ڪندا آهن، جيڪو مادي جي پيدائش واري رستي ۾ سگنلنگ ڪيسڪيڊ کي چالو ڪندو آهي، جنهن جي نتيجي ۾ ملن جي عدم استحڪام پيدا ٿيندي آهي. جيتوڻيڪ، جيتوڻيڪ vertebrates ۾ ڪيترائي اسٽيرائيڊ هارمون هوندا آهن، جهڙوڪ ايسٽروجن ۽ اينڊروجن (حوالو 9 ۾ جائزو ورتو ويو آهي)، اسان جي ڄاڻ موجب، اينڊروجنڪ-متعصب اسٽيرائيڊز جي ڪيڙن ۾ سڃاڻپ نه ڪئي وئي آهي.
اسان ممڪن تبديل ٿيندڙ اسٽيرائڊز جي ڳولا ۾ جنسي طور تي بالغ A. gambiae جي مرد رسائي غدود (MAG) ۾ اسٽيرائڊ هارمونز جي ذخيري کي طئي ڪرڻ لاءِ نڪتا آهيون. اڳ ۾ استعمال ٿيل گهٽ مخصوص طريقي جي بدران ٽينڊم ماس اسپيڪٽروميٽري (HPLC-MS/MS) سان گڏ اعليٰ ڪارڪردگي واري مائع ڪروميٽوگرافي کي استعمال ڪندي، اسان هن ٽشو ۾ ايڪڊيسون (E) ۽ 20E کي ڳولي لڌو، جيڪو پوئين نتيجي جي تصديق ڪري ٿو. بهرحال، نموني تي آڪسائيڊ ٿيل فاسفوريلائيڊ اسٽيرائڊز جو غلبو هو، فارمولا 3-ڊيهائيڊرو-20E-22-فاسفيٽ (3D20E22P)12 (شڪل 1) سان مطابقت رکي ٿو. ٻين شڪلن ۾ 3-ڊيهائيڊرو-20E (3D20E) ۽ 20E-22-فاسفيٽ (20E22P) شامل آهن. 3D20E22P جي HPLC-MS/MS سگنل جي شدت ان جي ڊيفاسفوريلائيڊ فارم، 3D20E کان ٻه آرڊر شدت کان وڌيڪ هئي، ۽ E ۽ 20E کان ٽي آرڊر شدت کان وڌيڪ هئي (شڪل 1). جيتوڻيڪ جسم جي ٻين حصن ۽ هيٺين پيدائش واري رستي ۾ (LRT؛ وڌايل ڊيٽا شڪل 1a). اسان نون بند ٿيل (<1 ڏينهن جي عمر) مردن ۽ عورتن ۾ ايڪڊيسٽرائڊس جو تجزيو پڻ ڪيو ۽ صرف MAG ۾ 3D20E ۽ 3D20E22P کي ڳولي لڌو؛ E، 20E ۽ 20E22P ٻنهي جنسن ۾ موجود هئا (وڌايل ڊيٽا شڪل 1b). اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته A. gambiae بالغ مرد پنهنجي MAGs ۾ تبديل ٿيندڙ هارمونز جا اعليٰ ٽائيٽر پيدا ڪن ٿا جيڪي عورتن پاران ٺهيل نه آهن.
MAG ۽ مادي LRT (جنهن ۾ ايٽريا، سيمينل ويسڪلز، ۽ پاروويريم شامل آهن) 4 ڏينهن جي عمر وارن (4 ڏينهن جي عمر وارن) ڪنوارين نر ۽ ڪنوارين ۽ ملائي عورتن (0.5، 3، ۽ 12 hpm) مان ڪٽيا ويا. انهن ٽشوز ۾ ايڪڊيسون جو تجزيو HPLC-MS/MS (مطلب ± sem؛ غير جوڙيل ٽي-ٽيسٽ، ٻه طرفي، غلط دريافت جي شرح (FDR) درست ڪيو ويو؛ NS، اهم نه؛ *P < 0.05، **P < 0.01. 3D20E: 3 ڪلاڪ بمقابله 0.5 ڪلاڪ، P = 0.035؛ 12 ڪلاڪ بمقابله 3 ڪلاڪ، P = 0.0015؛ 12 ڪلاڪ بمقابله 0.5 ڪلاڪ، P = 0.030. 3D20E22P: 3 ڪلاڪ بمقابله 0.5 ڪلاڪ، P = 0.25؛ 12 ڪلاڪ بمقابله. 3 ڪلاڪ، P = 0.0032؛ 12 ڪلاڪ بمقابله 0.5 ڪلاڪ، P = 0.015). ڊيٽا ٽن حياتياتي نقلن مان آهن. دلچسپي جي هر ايڪڊيسون لاءِ چوٽي واري علائقي کي مڇرن جي تعداد جي حساب سان ۽ عام ڪيو ويو. ايڪڊيسون کي رنگ سان هن ريت ظاهر ڪيو ويو آهي: E، سائو؛ 20E، نارنگي؛ 20E22P، جامني؛ 3D20E، نيرو؛ 3D20E22P، گلابي. انسيٽ گهٽ ايڪڊيسون سطح ڏيکارڻ لاءِ y-محور تي پيماني کي وڌائي ٿو.
اهو جانچڻ لاءِ ته ڇا 3D20E22P ۽ 3D20E ملن دوران منتقل ٿين ٿا، اسان ملن کان پوءِ مختلف وقتن تي مادي LRTs کي ڪٽيو. جيتوڻيڪ ڪنوارين ۾ ايڪڊيسون نه مليو، اسان ملن کان فوري طور تي LRT ۾ 3D20E22P جي وڏي مقدار ڏٺي (0.5 ڪلاڪ پوسٽ ميٽنگ، hpm)، وقت سان گڏ گهٽجي وئي، جڏهن ته 3D20E جي سطح خاص طور تي وڌي وئي (شڪل 1). ڪيميائي طور تي ٺهيل 3D20E کي معيار طور استعمال ڪندي، اسان اهو طئي ڪيو ته ميٽنگ LRTs ۾ هن اسٽيرائيڊ هارمون جي سطح 20E کان گهٽ ۾ گهٽ 100 ڀيرا وڌيڪ هئي (وڌايل ڊيٽا ٽيبل 1). اهڙيءَ طرح، 3D20E22P مکيه نر ايڪڊيسون آهي جيڪو ملن دوران مادي LRT ڏانهن منتقل ٿئي ٿو، ۽ ان جو ڊيفاسفوريلٽيڊ فارم، 3D20E، ملن کان ٿوري دير بعد تمام گهڻو وڌي ويندو آهي. اهو مادي پوسٽ ميٽنگ حياتيات ۾ بعد واري ايڪڊيسون لاءِ هڪ اهم ڪردار جو مشورو ڏئي ٿو.
هڪ نئين آر اين اي سيڪوئنسنگ (آر اين اي-سيڪ) ڊيٽاسيٽ (شڪل 2a) ٺاهڻ کان پوءِ، هڪ ڪسٽم-بلٽ بايو انفارميٽڪس پائپ لائن استعمال ڪندي، اسان ايڪڊيسون ڪائنس (اي سي ڪي)، ايڪڊيسون آڪسائيڊيس (اي او)، ۽ ايڪڊيسون انڪوڊنگ 20 اي-تبديل ٿيل فاسفيٽيس جين جي ڳولا ڪئي. اي پي پي) پيدائشي ٽشوز ۾ ظاهر ٿئي ٿو. اسان هڪ اميدوار اي پي پي جين ۽ ٻه امڪاني اي سي ڪي جين (اي سي ڪي 1 ۽ اي سي ڪي 2) جي سڃاڻپ ڪئي، پر هڪ سٺو اميدوار اي او جين ڳولڻ ۾ ناڪام رهيا. خاص طور تي، انفرادي اي پي پي جين گيمبين ايم اي جيز ۾ اعليٰ سطحن (98.9 هين پرسنٽائل) تي ظاهر ڪيا ويا پر عورت ايل آر ٽيز (شڪل 2b) ۾ نه، اسان جي اميدن جي برعڪس جڏهن کان هن عورت ٽشو ۾ 3D20E22P جو ڊيفاسفوريليشن ٿيو. تنهن ڪري، اسان يقين رکون ٿا ته مرد اي پي پي کي ملن دوران منتقل ڪري سگهجي ٿو. حقيقت ۾، اسان ملاوٽ کان پوءِ عورت پروٽين کي ماسڪ ڪرڻ لاءِ ويوو اسٽيبل آئسوٽوپ ليبلنگ استعمال ڪيو، هڪ اينزائم جيڪو ايم ايس پاران عورت ايٽريم ۾ سڃاڻپ ڪيو ويو (شڪل 2c ۽ ضمني) ٽيبل 1). ايم اي جي ۽ ميٽيڊ (پر ڪنواري نه) عورت ايل آر ٽي ۾ اي پي پي جي موجودگي جي تصديق پڻ مخصوص اينٽي باڊيز استعمال ڪندي ڪئي وئي (شڪل 2d).
الف، هڪ ڪسٽم ٺهيل بايو انفارميٽڪس پائپ لائن جيڪا هر جنس جي پيدائشي بافتن کي EcKs، EOs، ۽ EPPs کي انڪوڊ ڪندڙ جينز لاءِ ڳولي ٿي. تيرن جي اڳيان انگ هر قدم تي مرد ۽ عورت اميدوارن جي تعداد کي ظاهر ڪن ٿا. هن تجزيي ۾ هڪ EPP جين (EPP) ۽ هڪ EcK جين (EcK1) جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي جيڪي نر ۾ ظاهر ڪيا ويا آهن، ۽ هڪ EcK جين (EcK2) جيڪو ٻنهي جنسن ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي پر اميدوار EO جين پيدا نٿو ڪري. b، هيٽ ميپ ڪنوار (V) ۽ ميٽنگ (M) اينوفيلس گيمبيا ۽ اينوفيلس البيڪنس ٽشوز ۾ اميدوار جين جي اظهار جو مقابلو ڪري ٿو. Spca، ڀاڻ؛ MAGs، نر ۾ معاون غدود؛ جسم جا ٻيا حصا، جن ۾ سينو، پر، پير، چربی جسم، ۽ ٻنهي جنسن ۾ اندروني عضوا، ۽ عورتن ۾ بيضه شامل آهن. EcK2 گيمبيا جي MAG ۽ atria ٻنهي ۾ تمام گهڻو ظاهر ٿئي ٿو، جڏهن ته EPP صرف MAG ۾ ملي ٿو.c، مرد انزال گروپ جي عورت atria ۾ منتقلي جو پروٽومڪ تجزيو 3، 12 ۽ 24 hpm تي، جيڪو 67 سڀ کان وڌيڪ وافر پروٽين ڏيکاري ٿو. عورتن کي 15N تي مشتمل غذا تي پاليو ويو ته جيئن سڀني پروٽين کي ليبل (۽ ماسڪ) ڪري سگهجي. غير ٽيگ ٿيل نر ٽيگ ٿيل مادي سان ملايا ويا، ۽ عورت LRTs کي پروٽومڪ تجزيو لاءِ 3، 12 ۽ 24 hpm تي ڪٽيو ويو (انزال ڪندڙ پروٽين جي مڪمل فهرست لاءِ ضمني جدول 1 ڏسو). انهن ٽشوز جي پروٽومڪ تجزيي ذريعي ڪنوارن مردن جي MAG ۾ انسيٽ، EPP، Eck1 ۽ EcK2 کي دريافت ڪيو ويو.d، EPP کي MAG ۾ ويسٽرن بلوٽ ۽ ملائي عورتن جي LRT ذريعي معلوم ڪيو ويو، پر ڪنوارن عورتن يا نر يا باقي ۾ نه. عورت جو جسم. جھليون هڪ ئي وقت اينٽي ايڪٽين (لوڊنگ ڪنٽرول) ۽ اينٽي اي پي پي اينٽي باڊيز سان جاچيون ويون. سڀئي مرد ڪنوارا آهن. جيل سورس ڊيٽا لاءِ ضمني شڪل 1 ڏسو. ساڳئي نتيجن سان مغربي بلاٽس ٻه ڀيرا ڪيا ويا.
EPP جي ايڪڊيسٽرائيڊ فاسفوفاسفيٽيس سرگرمي کي HPLC-MS/MS پاران MAG کان الڳ ٿيل 3D20E22P سان انڪيوبيشن کان پوءِ تصديق ڪئي وئي (وڌايل ڊيٽا شڪل 2a). وڌيڪ، جڏهن اسان RNA-mediated interference (RNAi) ذريعي EPP کي خاموش ڪيو، ته اسان انهن نر جي پيدائشي بافتن ۾ فاسفيٽيس سرگرمي ۾ هڪ مضبوط گهٽتائي ڏٺي (شڪل 3a)، ۽ EPP-silenced نر سان ملندڙ عورتن جزوي جين خاموش ٿيڻ جي باوجود ڊيفاسفوريلٽيڊ 3D20E (شڪل 3b) جو گهٽ تناسب ڏيکاريو (وڌايل ڊيٽا شڪل 2b،c). ان جي ابتڙ، اسان ساڳئي مڇرن ۾ 20E22P/20E تناسب ۾ اهم تبديليون نه ڏٺيون، جيڪي شايد اهو مشورو ڏين ٿيون ته اينزائم 3D20E22P لاءِ مخصوص آهي (شڪل 3b).
a، ڊبل اسٽرينڊڊ EPP RNA (dsEPP) يا ڊبل اسٽرينڊڊ GFP RNA (dsGFP) ڪنٽرول استعمال ڪندي EPP خاموش ڪرڻ جي ڪري MAG ۾ فاسفيٽيس سرگرمي ۾ گهٽتائي آئي. هر نقل ۾ ويهه MAG پول استعمال ڪيا ويا (P = 0.0046، جوڙيل ٽي-ٽيسٽ، ٻه طرفي)، الڳ الڳ نقطن سان نمائندگي ڪئي وئي. b، EPP-خاموش مردن سان ملندڙ عورتن ۾ 3 hpm تي ڊيفاسفوريلٽيڊ 3D20E جو تناسب گهٽ هو (P = 0.0043، بنا جوڙيل ٽي-ٽيسٽ، ٻه طرفي)، جڏهن ته 20E سطحون متاثر نه ٿيون (P = 0.063، بنا جوڙيل). ٽي-ٽيسٽ، ٻه طرفي). ڊيٽا 13، 16 ۽ 19 عورتن جي ٽن پولن مان سراسري ± سيم جي طور تي پيش ڪئي وئي آهي. c، EPP-خاموش مردن سان ملائيل عورتن ۾ ٻيهر ملائيل جي شرح تمام گهڻي هئي (P = 0.0002، فشر جو صحيح ٽيسٽ، ٻه طرفي). عورتن کي پهريان انهن جي ملائيل جي حيثيت کي يقيني بڻائڻ لاءِ ملائيل ڪرڻ تي مجبور ڪيو ويو؛ 2 ڏينهن کان پوءِ، انهن کي ٽرانسجينڪ سپرم کڻندڙ ٻين مردن سان رابطو ڪيو ويو ته جيئن ٽرانسجين جي مقداري پي سي آر جي ڳولا ذريعي ٻيهر ملائڻ جي شرح جو جائزو ورتو وڃي. ڊي، اي پي پي-خاموش نر سان ملندڙ رت سان پيار ڪندڙ عورتن ۾ زرخيزي گهٽجي وئي هئي (پي < 0.0001؛ مان-وٽني ٽيسٽ، ٻه طرفي) ۽ انڊا جو تعداد ٿورو گهٽجي ويو (پي = 0.088، مان-وٽني ٽيسٽ، ٻه طرفي)، جڏهن ته اسپوننگ جي شرح متاثر نه ٿي (پي = 0.94، فشر جو صحيح ٽيسٽ، ٻه طرفي). سڀني پينلن ۾، n حياتياتي طور تي آزاد مڇر جي نمونن جي تعداد جي نمائندگي ڪري ٿو. اين ايس، اهم نه آهي.*پي < 0.05، **پي < 0.01، ***پي < 0.001، ****پي < 0.001.
اڳيون، اسان جائزو ورتو ته ڇا ايڪڊيسون ڊيفاسفوريليشن عورتن ۾ ملن جي مزاحمت کي وڌائڻ لاءِ اهم آهي. خاص طور تي، EPP-ختم ٿيل نر سان ملائي ويندڙ عورتون ڪنٽرول عورتن (10.4٪) جي ڀيٽ ۾ تمام گهڻي فريڪوئنسي (44.9٪) تي ٻيهر ملائي وينديون آهن جڏهن اضافي (ٽرانسجينڪ) نر (شڪل 3c) جي سامهون اينديون آهن. اسان زرخيزي ۾ هڪ اهم گهٽتائي (شڪل 3d، کاٻي) ۽ انهن مادين پاران ڏنل انڊن جي تعداد ۾ معمولي گهٽتائي (شڪل 3d، وچ) پڻ ڏٺي، جڏهن ته مادين پاران ڏنل انڊن جو سيڪڙو (شڪل 3d، ساڄي) متاثر نه ٿيو. 3D20E22P لاءِ EPP جي مشاهدي واري خاصيت کي ڏنو ويو، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ملن دوران منتقل ٿيل EPP پاران 3D20E جي چالو ٿيڻ سان وڌيڪ ملن لاءِ عورتن جي قبوليت کي بند ڪرڻ ۾ اهم ڪردار ادا ٿي سگهي ٿو، هڪ رويي جيڪو اڳ ۾ 20E جي جنسي منتقلي سان منسوب ڪيو ويو هو. تنهن ڪري، هي نر مخصوص هارمون پڻ عورت جي زرخيزي کي سختي سان متاثر ڪري ٿو.
اڳيون، اسان ڪيميائي طور تي ٺهيل 3D20E (شڪل 4a-c) ۽ تجارتي طور تي دستياب 20E استعمال ڪندي جنسي طور تي بالغ ڪنوارين ۾ انجڪشن تجربن ۾ 20E ۽ 3D20E جي سرگرمين جو مقابلو ڪيو. اسان ڏٺو ته 3D20E ٻنهي ڪنسنٽريشنز تي ملن لاءِ عورتن جي حساسيت کي بند ڪرڻ ۾ 20E کان وڌيڪ اثرائتو هو (شڪل 4d). قابل ذڪر طور تي، LRT ۾ 3D20E جي اڌ جسماني سطح (1,066 pg پوسٽ انجيڪشن بمقابله 2,022 pg پوسٽ انجيڪشن) ريفريڪٽري عورتن جو تناسب پيدا ڪيو جيڪو 20E (361 pg پوسٽ انجيڪشن) جي جسماني سطح کان 20 ڀيرا وڌيڪ هو 24 ڪلاڪن کان پوءِ انجيڪشن کان پوءِ سڀ کان وڌيڪ ڪنسنٽريشن 18 pg پوسٽ انجيڪشن تي؛ وڌايل ڊيٽا ٽيبل 1). هي نتيجو ان خيال سان مطابقت رکي ٿو ته 20E جي جنسي منتقلي ميٽنگ ريفريڪٽري دورن جو سبب نه بڻجندي آهي، ۽ وڌيڪ 3D20E کي والدين-ٻار جي رشتي کي يقيني بڻائڻ ۾ هڪ اهم عنصر جي طور تي اشارو ڪري ٿو. 3D20E ڪنواري عورتن ۾ آنا ڏيڻ جي جاچ ۾ 20E کان وڌيڪ فعال هو (شڪل 4e)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته جزوي EPP خاموش ٿيڻ کان پوءِ اسان ڏٺو ته عام آنا ڏيڻ جي شرح باقي 3D20E سرگرمي جي موجودگي جي ڪري هئي جيڪا اڃا تائين ملن-حوصلہ افزائي عورت عنصرن پاران پيدا ڪئي وئي آهي.
(a,b) 3D20E ڪيميائي طور تي 20E (a) مان ٺهيل تمام گهڻي تبديلي/ڪارڪردگي سان (ڊيٽا ٽن آزاد سنٿيسس رد عملن مان اوسط ± سيم طور پيش ڪيو ويو آهي) (b).c، ماس اسپيڪٽرم (هيٺيون اڌ) بلڪل ملندڙ عورت LRT (مٿين اڌ) ۾ مليل ايڪڊيسون سان ملندو آهي.d، 20E (0.63 µg، P = 0.02؛ 0.21 µg، P < 0.0001؛ فشر جو صحيح ٽيسٽ، ٻه طرفو) ۽ 10٪ ايٿانول (0.63 µg، P < 0.0001؛ 0.21 µg، P < 0.0001؛ فشر جو صحيح ٽيسٽ، 2 طرفو) جي مقابلي ۾، جڏهن ته 20E صرف وڌيڪ مقدار ۾ ڪنٽرول کان گهڻو وڌيڪ هو (0.63 µg، P = 0.0002؛ 0.21 µg، P = 0.54؛ فشر جو صحيح ٽيسٽ، 2-طرفي).e، 3D20E انجيڪشن ڪنواري عورتن ۾ 10٪ ايٿانول ڪنٽرولن جي ڀيٽ ۾ خاص طور تي وڌيڪ اسپوننگ جي شرح کي متاثر ڪيو (0.21 µg، P < 0.0001؛ 0.13 µg، P = 0.0003؛ فشر جو صحيح ٽيسٽ، ٻه طرفي)، جڏهن ته 20E ڪنٽرولن جي مقابلي ۾ صرف وڌيڪ دوائن تي (0.21 µg، P = 0.022؛ 0.13 µg، P = 0.0823؛ فشر جو صحيح ٽيسٽ، ٻه طرفي).3D20E وڌيڪ دوائن تي 20E جي ڀيٽ ۾ خاص طور تي وڌيڪ اسپوننگ جي شرح کي متاثر ڪيو (0.21 µg، P = 0.0019؛ 0.13 µg، P = 0.075؛ فشر جو صحيح ٽيسٽ، ٻه طرفي). سڀني پينلن ۾، n حياتياتي طور تي آزاد مڇر جي نمونن جي تعداد جي نمائندگي ڪري ٿو.NS، اهم نه آهي.*P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001. ڊيٽا ٽن نقلن مان آهن.
پوئين مطالعي ۾، اسان اهو طئي ڪيو ته اسٽيرائيڊ هارمونز جي جنسي منتقلي MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) جي اظهار کي متاثر ڪري ٿي، هڪ عورت جي پيدائشي جين جيڪا A. gambiae عورتن کي P. falciparum انفيڪشن کان بچائي ٿي. صحت جي قيمت 13 جي ڪري، سڀ کان خطرناڪ انساني مليريا پيراسائٽ. مليريا جي علائقن ۾ اينوفيليس جي پيدائشي فٽنيس لاءِ MISO جي اهميت کي ڏنو ويو، اسان اهو طئي ڪرڻ جو فيصلو ڪيو ته ڪهڙو هارمون 3D20E يا 20E هن جين جي اظهار کي متحرڪ ڪري ٿو. اسان ڏٺو ته جڏهن 20E انجيڪشن خاص طور تي يا وڌيڪ طاقتور طور تي ڪجهه نيوڪليئر هارمون ريڪٽرز (HR) کي متاثر ڪري ٿو، جهڙوڪ HR3 ۽ HR4، ۽ عام ڊائون اسٽريم ٽارگيٽ، جهڙوڪ يولڪوجينڪ جينز Vg14، 15، 16، MISO وڌيڪ مضبوط طور تي 3D20E (وڌايل ڊيٽا شڪل 3) پاران متاثر ڪيو ويو. اهڙيءَ طرح، هن اينڊروجنڪ اسٽيرائيڊ هارمون جي جنسي منتقلي اهڙي ميڪانيزم کي متاثر ڪرڻ لڳي ٿي جيڪا عورتن کي پرجيتي انفيڪشن جي ڪري پيدا ٿيندڙ خرچن کان بچائي ٿي. وڌيڪ، 3D20E مختلف طور تي E ريڪٽر EcR جي ٻنهي آئسفارمز کي متاثر ڪري ٿو، EcR-A کي متاثر ڪري ٿو ۽ EcR-B کي دٻائي ٿو، ۽ وڌيڪ مضبوطيءَ سان ٻين ميٽنگ پيدا ڪندڙ جينز کي متحرڪ ڪري ٿو، جنهن ۾ HPX15 شامل آهي، جيڪو عورتن جي زرخيزي کي متاثر ڪري ٿو. اهو EPP-خاموش مردن سان ملندڙ عورتن ۾ مشاهدو ڪيل اهم بانجھ پن جي وضاحت ڪري سگهي ٿو (وڌايل ڊيٽا شڪل 3). اهي ڊيٽا ٻن ايڪڊيسون هارمونز پاران ترجيحي طور تي چالو ٿيندڙ هيٺئين وهڪري جي رستن جي وجود جو مشورو ڏين ٿا جيڪي جنس جي مخصوص ڪم کي بنياد بڻائي سگهن ٿا.
اڳيون، اسان اسان جي بايو انفارميٽڪس پائپ لائن ۾ سڃاڻپ ڪيل ٻن EcK جين جي ڪم جي جانچ ڪئي. EcK1 يا EcK2 کي خاموش ڪرڻ سان مردن ۾ اهم موت واقع ٿي (وڌايل ڊيٽا شڪل 4a)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ايڪڊيسون فاسفوريليشن، ۽ ان ڪري غير فعال ٿيڻ، بقا لاءِ اهم آهي. ڇاڪاڻ ته EcK2 EcK1 کان وڌيڪ سطحن تي ظاهر ڪيو ويو هو ۽ پروٽومڪس پاران MAGs ۾ دريافت ڪيو ويو (شڪل 2b، c ۽ ضمني جدول 2)، اسان ان جي ايڪڊيسٽرائيڊ ڪائنس سرگرمي کي 20E سان انڪيوبيٽ ڪندي تصديق ڪئي، جنهن جي نتيجي ۾ فاسفوريليشن 20E22P (وڌايل ڊيٽا شڪل 2).4b). جڏهن 3D20E کي سبسٽريٽ طور استعمال ڪيو ويو، اسان فاسفوريلٽيڊ پراڊڪٽ 3D20E22P (وڌايل ڊيٽا شڪل 4c) کي ڳولڻ جي قابل نه هئاسين، اهو مشورو ڏئي ٿو ته 3D20E جي بدران 20E EcK2 جو ترجيحي هدف ٿي سگهي ٿو.
اسان جي آر اين اي-سيڪ تجزيي موجب، ڪنواري عورتن جي LRT ۾ EcK2 پڻ تمام گهڻو ظاهر ڪيو ويو، جتي اهو ملن کان پوءِ بند ڪيو ويو (شڪل 2b). اسان انهن ڊيٽا جي تصديق ڪئي ۽ اهو طئي ڪيو ته EcK2 اظهار رت جي فيڊنگ کان متاثر نه ٿيو (وڌايل ڊيٽا شڪل 5a). اسان جي شروعاتي MS تجربن کي وڌايو، اسان اهو طئي ڪيو ته 20E22P جي چوٽي 20E جي چوٽي سان ويجهي سان لاڳاپيل هئي (رت جي کاڌي کان 22-26 ڪلاڪ؛ وڌايل ڊيٽا شڪل 5b). ڪنواري عورتن ۾ EcK2 جي خاموشي جي نتيجي ۾ رت جي کاڌي کان 26 ڪلاڪن بعد 20E کان 20E22P جي نسبتي تناسب ۾ 3 ڀيرا اضافو ٿيو (وڌايل ڊيٽا شڪل 2c ۽ 5c)، تصديق ڪري ٿو ته EcK2 عورتن ۾ 20E کي فاسفوريليٽس پڻ ڪري ٿو. خاص طور تي، EcK2-ختم ٿيل ڪنواري مڪمل جنسي قبوليت برقرار رکي ٿي (وڌايل ڊيٽا شڪل 5d،e)، وڌيڪ اهو مشورو ڏئي ٿو ته 20E جي عورت جي پيداوار ملن کي متاثر نه ڪندي آهي. ريفريڪٽري پيريڊس. بهرحال، انهن عورتن ۾ ڪنٽرول جي مقابلي ۾ آنا ڏيڻ جي شرح ۾ خاص طور تي اضافو ٿيو هو، 30 سيڪڙو کان وڌيڪ ڪنوارين آنا ڏينديون هيون (وڌايل ڊيٽا تصوير 5f). جيڪڏهن رت جي فيڊنگ کان پوءِ ڊبل اسٽرينڊڊ Eck2 RNA (dsEcK2) انجيڪشن ڪيا ويا هئا، ته پوءِ اسپوننگ نه ٿي هئي، جنهن وقت رت جي انجيڪشن جي ڪري 20E جي چوٽي گهٽجي وئي هئي. مجموعي طور تي، اهي نتيجا هڪ ماڊل جي حمايت ڪن ٿا ته رت چوسڻ کان پوءِ پيدا ٿيندڙ 20E اسپوننگ کي متاثر ڪري سگهي ٿو، پر صرف تڏهن جڏهن اسپوننگ بلاڪ (EcK2 ۽ ممڪن طور تي ٻيا عنصر) ملن ذريعي بند ڪيو وڃي. نه ته 20E ۽ نه ئي 3D20E انجيڪشن ڪنوارين ۾ EcK2 اظهار کي روڪيو (وڌايل ڊيٽا تصوير 5g)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ٻيا عنصر هن ڪائنس جي روڪٿام ۾ ثالثي ڪن ٿا. بهرحال، رت جي فيڊنگ کان پوءِ 20E جي سطح ملن جي تڪليف پيدا ڪرڻ لاءِ ڪافي نه هئا، پر جنسي طور تي منتقل ٿيل 3D20E جي اعلي ٽائيٽرز پاران مؤثر طريقي سان شروع ڪيا ويا.
اسان جا نتيجا A. gambiae جي پيدائشي ڪاميابي کي منظم ڪرڻ واري ميڪانيزم ۾ اهم بصيرت فراهم ڪن ٿا. هڪ ماڊل سامهون آيو آهي جتي نر 3D20E جي اعليٰ ٽائيٽرز کي گڏ ڪرڻ لاءِ ارتقا پذير ٿيا آهن، هڪ نر-مخصوص تبديل ٿيل ايڪڊيسون جيڪو عورتن کي وڌيڪ ملن لاءِ غير حساس بڻائي والدين کي يقيني بڻائي ٿو. ساڳئي وقت، انهن مليريا ویکٹرز نر-مخصوص EPP جي جنسي منتقلي جي جواب ۾ عورتن ۾ 3D20E کي چالو ڪرڻ لاءِ هڪ ڪارآمد نظام پڻ تيار ڪيو آهي. اسان جي ڄاڻ موجب، هي نر- ۽ مادي جي تسلط واري اسٽيرائيڊ هارمون سسٽم جو پهريون مثال آهي جيڪو حشرات ۾ هڪ منفرد ۽ نازڪ ڪم ڪري ٿو. نر-مخصوص ايڪڊيسون فنڪشن کي پوسٽ ڪيو ويو آهي پر قطعي طور تي ظاهر نه ڪيو ويو آهي. مثال طور، هڪ وڏي حد تائين غلط ثابت ٿيل مفروضو 18 اهو آهي ته اهي ڪم 20E اڳوڻن E1 پاران انجام ڏئي سگهجن ٿا. اهو چڱي طرح معلوم آهي ته ڊروسوفلا ۾، مونانڊري ننڍڙن جنس پيپٽائڊس 19,20 جي جنسي منتقلي ذريعي شروع ٿئي ٿي جيڪي مخصوص جنس پيپٽائڊ ريڪٽرز 21,22 ذريعي عورت جي پيدائشي رستي کي متحرڪ ڪندڙ نيورون سان لهه وچڙ ڪن ٿا. وڌيڪ ڪم A. gambiae عورتن ۾ 3D20E پاران ڪنٽرول ٿيندڙ ڊائون اسٽريم سگنلنگ ڪيسڪيڊس کي طئي ڪرڻ ۽ اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا اهي ڪيسڪيڊس مڇرن ۽ ڊروسوفلا جي وچ ۾ محفوظ ٿي سگهن ٿا، ضروري آهي.
اسان جي مطالعي ۾ سڃاڻپ ڪيل عورتن جي زرخيزي ۽ رويي تي 3D20E جي اهم ڪردار کي ڏنو ويو آهي، 3D20E جي جوڙجڪ ۽ چالو ڪرڻ جا رستا مستقبل جي مڇر ڪنٽرول حڪمت عملين لاءِ نوان موقعا پيش ڪن ٿا، جهڙوڪ جراثيم کان پاڪ ڪيڙن جي ٽيڪنالاجي حڪمت عملين ۾ مقابلي واري جراثيم کان پاڪ نر نسل جهنگلي ڇڏڻ لاءِ استعمال ڪرڻ يا ڪنواري راند ۾ 3D20E جي نقل ڪرڻ لاءِ. 3D20E جو نر مخصوص ڪم تڏهن ترقي ڪري سگهيو آهي جڏهن A. gambiae ۽ ٻين سيليا نسلن پنهنجي مني کي ميٽنگ پلگ ۾ گڏ ڪرڻ جي صلاحيت حاصل ڪئي، ڇاڪاڻ ته اهو وڏي تعداد ۾ هارمونز ۽ هارمون کي چالو ڪندڙ اينزائمز جي موثر منتقلي جي اجازت ڏئي ٿو. موڙ ۾، 3D20E ارتقا لاڳو ڪندڙ مونانڊري عورتن لاءِ هڪ ميکانيزم فراهم ڪري ٿو (MISO جي اعلي اظهار ذريعي) انهن جي پيداواري صحت کي اعلي مليريا جي پکيڙ جي علائقن ۾ پسند ڪرڻ لاءِ، جيڪو اڻ سڌي طرح پلازموڊيم ٽرانسميشن ۾ حصو وٺندو آهي. ڏنو ويو آهي ته مادي 20E کي مادي اينوفيلس مڇرن ۾ P. falciparum جي بقا ۽ واڌ تي گہرا اثر ڏيکاريا ويا آهن، 24 نر ۽ مادي ٻئي اسٽيرائيڊ هارمون رستا هاڻي مڇر-پرازي جا اهم پهلو آهن. ڳالهه ٻولهه.
A. gambiae G3 قسمن کي معياري حشرات جي حالتن ۾ پاليو ويو (26-28 °C، 65-80% نسبتي نمي، 12:12 ڪلاڪ روشني/ڪارو فوٽو پيريڊ). لاروا کي پائوڊر ٿيل مڇي جي کاڌي سان کارايو ويو (ٽيٽرا من ٽراپيڪل فليڪس، ڪوئي پيليٽس ۽ ٽيٽرا تلاءَ جي اسٽڪس 7:7:2 جي تناسب ۾). بالغ مڇرن کي ايڊ ليبٽم 10٪ ڊيڪسٽروز محلول ۽ هفتيوار انساني رت (رت جي اجزاء جو مطالعو) کارايو ويو. ورجن مڇر مائڪروسڪوپي ذريعي سرن جي جانچ ڪرڻ کان پوءِ پوپل اسٽيج تي جنس کي الڳ ڪري حاصل ڪيا ويا. DsRed ٽرانسجين کڻندڙ نر اڳ ۾ بيان ڪيا ويا آهن.
زبردستي ملن جا تجربا اڳ ۾ بيان ڪيل پروٽوڪول مطابق ڪيا ويا. قدرتي ملن لاءِ، 4 ڏينهن جي ڪنواري عورتن کي ٻن راتين لاءِ جنسي طور تي بالغ ڪنوارين مردن سان 1:3 جي تناسب ۾ رکيو ويو. تجربن لاءِ جن ۾ نر ڊي ايس اي پي پي سان انجڪشن ڪيا ويا هئا، ڪو-ڪيجنگ انجيڪشن کان پوءِ 3-4 ڏينهن سان گڏ هئي، جڏهن فاسفيٽيس سرگرمي کي وڌ ۾ وڌ خاموش ڪيو ويو (وڌايل ڊيٽا شڪل 2b).
مڇر جي ٽشوز، باقي لاشن (باقي جسم)، يا سڄي جسم کي 100٪ ميٿانول ۾ ورهايو ويو ۽ هڪ بيڊر (2 ملي ميٽر گلاس بيڊ، 2,400 آر پي ايم، 90 سيڪنڊ) سان هڪجهڙائي ڪئي وئي. ٽشو جي مقدار ۽ ميٿانول جي مقدار هن ريت هئي: باقي جسم، 1,000 µl ۾ 50؛ MAG، 50-100 80 µl؛ عورت LRT، 25-50 80 µl. پريپيسيٽيٽ کي ميٿانول جي ساڳئي مقدار سان ٻيو ميٿانول ڪڍڻ جي تابع ڪيو ويو. سيل ملبہ سينٽرفيوگيشن ذريعي هٽايو ويو. ٻنهي ڪڍڻ مان ميٿانول کي گڏ ڪيو ويو ۽ نائٽروجن جي وهڪري هيٺ خشڪ ڪيو ويو، پوءِ پاڻي ۾ 80٪ ميٿانول جي هيٺين مقدار ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو: باقي جسم، 50 µl؛ MAGs ۽ عورت LRT، 30 µl.
نمونن جو تجزيو هڪ ماس اسپيڪٽروميٽر (ID-X، Thermo Fisher) تي هڪ LC اوزار (Vanquish، Thermo Fisher) سان ملائي ڪيو ويو. نموني جو 5 µl 3 µm، 100 × 4.6 mm ڪالم (Inspire C8، Dikma) تي 25 °C تي رکيو ويو. LC لاءِ موبائل مرحلا A (پاڻي، 0.1٪ فارمڪ ايسڊ) ۽ B (acetonitrile، 0.1٪ فارمڪ ايسڊ) هئا. LC گريڊينٽ هن ريت هو: 1 منٽ لاءِ 5٪ B، پوءِ 11 منٽن ۾ 100٪ B تائين وڌايو ويو. 8 منٽن کان پوءِ 100٪ تي، ڪالم کي 4 منٽن لاءِ 5٪ B تي ٻيهر متوازن ڪريو. وهڪري جي شرح 0.3 ml منٽ-1 هئي. MS ماخذ ۾ آئنائيزيشن مثبت ۽ منفي موڊ ۾ گرم اليڪٽرو اسپري آئنائيزيشن ذريعي حاصل ڪئي ويندي آهي.
ماس اسپيڪٽروميٽر مڪمل ايم ايس موڊ ۾ 60,000 ريزوليوشن تي 350 کان 680 تائين m/z رينج ۾ ڊيٽا کي ماپي ٿو. ايم ايس/ايم ايس ڊيٽا [M + H]+ (سڀئي هدف)، [M - H2O + H]+ (سڀئي هدف)، ۽ [M - H]- (فاسفوريلٽيڊ هدف) تي حاصل ڪيو ويو. ايم ايس/ايم ايس ڊيٽا انهن هدفن جي ايڪڊيسون خاصيتن جي تصديق ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو جن لاءِ ڪو معيار موجود نه هو. غير ٽارگيٽيڊ ايڪڊيسٽرائڊس جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ، 15٪ کان وڌيڪ نسبتي ڪثرت سان سڀني HPLC چوٽين لاءِ ايم ايس/ايم ايس ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو. هڪ مخصوص نموني (ٻين سڀني هدفن) جي مطلق مقدار يا ڊائيوليشن کي ڳڻڻ لاءِ خالص معيار (20E، 3D20E) مان ٺهيل معياري وکر استعمال ڪندي مقدار کي درست ڪريو ته جيئن هڪ نر ۾ مليل مقدارن جي برابري جو حساب ڪري سگهجي. 3D20E لاءِ، مقدار کي هيٺين اضافو جي رقم استعمال ڪندي انجام ڏنو ويو: [M + TFA]-، [M + COOH]-، [M + Na]+، [M + Cl]-، [M + NO3]-. ڊيٽا کي ٽريس فائنڊر (ورژن 4.1) استعمال ڪندي ڪڍيو ويو ۽ مقدار ۾ طئي ڪيو ويو. Xcalibur (ورزن 4.4) استعمال ڪندي MS/MS ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو. E، 20E ۽ 3D20E جي MS اسپيڪٽرا جو لاڳاپيل معيارن سان مقابلو ڪيو ويو. 3D20E22P جو تجزيو Girard جي ري ايجنٽ سان ڊيريويٽيزيشن ذريعي ڪيو ويو. 20E22P جو تجزيو m/z تناسب سان ڪيو ويو.
3D20E22P کي MAG مان صاف ڪيو ويو. صفائي هڪ تجزياتي پيماني تي هڪ الٽرا پرفارمنس مائع ڪروميٽوگراف (Acquity، Waters) استعمال ڪندي هڪ quadrupole mass-based detector (QDa، Acquity، Waters) سان HPLC-MS/MS تجزيي جي ساڳي LC حالتن هيٺ ڪئي وئي. فرڪشن ڪليڪشن تڏهن شروع ٿيو جڏهن 3D20E22P سان لاڳاپيل m/z ساڳئي برقرار رکڻ واري وقت تي معلوم ڪيو ويو جيئن اڳ ۾ طئي ڪيو ويو هو. ڪڍيل مرڪبن جي پاڪائي کي پوءِ HPLC-MS/MS پاران چيڪ ڪيو ويو جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي.
ٺاهيندڙ جي هدايتن تي عمل ڪندي TRI ريجنٽ (ٿرمو فشر) استعمال ڪندي 10-12 ريپروڊڪٽو ٽشوز يا جسم جي ٻين حصن (هيڊ ليس) مان ڪل RNA ڪڍيو ويو. ٺاهيندڙ جي هدايتن تي عمل ڪندي RNA کي TURBO DNase (ٿرمو فشر) سان علاج ڪيو ويو. cDNA کي ٺاهيندڙ جي هدايتن تي عمل ڪندي Moloney murine leukemia وائرس ريورس ٽرانسڪرپٽيس (M-MLV RT؛ Thermo Fisher) استعمال ڪندي سنٿيسائيز ڪيو ويو. ريورس ٽرانسڪرپشن مقداري PCR (RT-qPCR؛ وڌايل ڊيٽا ٽيبل 2) لاءِ پرائمر اڳ ۾ شايع ڪيا ويا هئا24 يا پرائمر-BLAST26 استعمال ڪندي ڊزائين ڪيا ويا هئا، ترجيح 70-150 bp سائيز ۽ اسپننگ ايڪسون-ايڪسون جنڪشن يا پرائمر پيئر پرائمر الڳ ايڪسون جي شين کي ڏني وئي هئي. ٽن کان چار حياتياتي نقلن مان cDNA نمونن کي RT-qPCR لاءِ پاڻي ۾ چار ڀيرا ملائي ڇڏيو ويو. مقدار 15 µl نقل رد عملن ۾ ڪئي وئي جنهن ۾ 1× PowerUp SYBR گرين ماسٽر مکس (ٿرمو فشر)، پرائمر، ۽ 5 µl diluted cDNA شامل هئا. رد عمل هڪ تي هلايا ويا. ڪوانٽ اسٽوڊيو 6 پرو ريئل ٽائيم پي سي آر سسٽم (ٿرمو فشر) ۽ ڊيٽا گڏ ڪئي وئي ۽ ڊيزائن ۽ تجزيو (ورژن 2.4.3) استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو. جيئن هن مطالعي ۾ ڏيکاريو ويو آهي، لاڳاپيل مقدار کي رائبوسومل جين RpL19 (AGAP004422) سان نارمل ڪيو ويو، جنهن جو اظهار رت جي فيڊنگ 27 يا ميٽنگ 3 سان خاص طور تي تبديل نه ٿيو.
آر اين اي جي معيار کي ايجيلنٽ بايو اينالائيزر 2100 بايو اينالائيزر (ايجيلنٽ) استعمال ڪندي جانچيو ويو. ايلومينا پيئرڊ اينڊ لائبريريون تيار ڪيون ويون ۽ براڊ انسٽيٽيوٽ آف ايم آءِ ٽي ۽ هارورڊ ۾ هلايون ويون. سيڪوئنسنگ ريڊز کي اي. گيمبي ​​جينوم (پي اي ايس ٽي اسٽرين، ورجن 4.12) سان HISAT2 (ورجن 2.0.5) استعمال ڪندي ڊفالٽ پيرا ميٽرز سان ترتيب ڏنو ويو. ميپنگ ڪوالٽي (MAPQ) اسڪور سان ريڊز <30 کي سام ٽولز (ورجن 1.3.1) استعمال ڪندي هٽايو ويو. جينز سان ميپ ٿيل ريڊز جو تعداد ڊفالٽ پيرا ميٽرز سان htseq-count (ورجن 0.9.1) استعمال ڪندي ڳڻيو ويو. عام پڙهڻ جي ڳڻپ جو حساب ڪيو ويو ۽ آر (ورجن 4.0.3) ۾ DESeq2 پيڪيج (ورجن 1.28.1) استعمال ڪندي ڊفرنشل جين ايڪسپريشن جو تجزيو ڪيو ويو.
ايڪڊيسون-ترميم ڪندڙ جين اميدوارن جي سڃاڻپ پهرين PSI-BLAST الگورتھم (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) استعمال ڪندي A. gambiae جينوم جي ڳولا ڪندي ڪئي وئي، ڊفالٽ ويلوز استعمال ڪندي هيٺ ڏنل سوال پروٽين جي ترتيب سان پيرا ميٽرز: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1)، Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1، XP_005175332.1 ۽ XP_011294434.1) ۽ Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 ۽ XP_008552645.1) EcK from B. mori (Accession No. NP_001036900)، Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202)، ايپس ميليفيرا (ايڪسيشن نمبر XP_394838) ۽ ايڪيرٿوسيفون پيسم (ايڪسيشن نمبر XP_001947166)؛ ۽ اي پي پي کان بي. موري (ايڪسيشن نمبر XP_001947166) NP_001177919.1 ۽ NP_001243996.1) ۽ ڊي. ميلانوگاسٽر (ايڪسيشن نمبر NP_572986.1) جي EO (قدم 1). اڳيون، گيمبيا ۾ پيدائشي ٽشو (عورت LRT يا MAG) ۾ اعلي mRNA اظهار (> 100 ٽڪرا/ڪلو بيس ايڪسون في ملين ميپ ٿيل ريڊز (FPKM) يا > 85%) جي بنياد تي فلٽر هٽ (قدم 2). خاصيت کي بهتر بڻائڻ لاءِ، اسان اميدوار اينزائمز چونڊيا جيڪي A. albimanus جي پيدائشي ٽشو ۾ پڻ ظاهر ڪيا ويندا آهن، هڪ اينوفيلس نسل جيڪو ملن دوران ايڪڊيسون کي سنٿيسائيز يا منتقل نه ڪندو آهي. اميدوار جين کي A. albimanus جي پيدائشي ٽشو (قدم 3) ۾ گهٽ اظهار (<100 FPKM يا <85th پرسنٽائل) جي بنياد تي فلٽر ڪيو ويو. آخري فلٽر (قدم 4) جي طور تي، اميدوار جين کي گهٽ ۾ گهٽ هيٺين مان هڪ کي پورو ڪرڻ جي ضرورت آهي: (1) ميلاپ کان پوءِ خاص طور تي اپ-ريگيولڊ (P < 0.05) مختلف طور تي ظاهر ڪيل جين جي تجزيي مطابق ۽ (2) غير پيداواري ٽشوز ۾ (<85٪ يا <100 FPKM).
اسان اڳ ۾ بيان ڪيل طريقن 28,29,30 کي تبديل ڪيو ته جيئن پوري عضوي جي آئسوٽوپڪ ليبلنگ حاصل ڪري سگهجي. مختصر طور تي، جهنگلي قسم جي Saccharomyces cerevisiae قسم II (YSC2، سگما) کي خمير نائٽروجن بيس (BD Difco، DF0335) ۾ آزمايو ويو جنهن ۾ (wt/vol) 2٪ گلوڪوز (G7528، سگما)، 1.7٪ امينو ايسڊ فري ۽ امونيم سلفيٽ شامل هئا. ڪلچر ميڊيم) ۽ 5٪ 15N امونيم سلفيٽ (NLM-713، >99٪، ڪيمبرج آئسوٽوپ ليبارٽريز) نائٽروجن جو واحد ذريعو طور. خمير کي سينٽرفيوگيشن ذريعي بحال ڪيو ويو ۽ مڇر جي لاروا کي پيپشن تائين ايڊ ليبٽم کارايو ويو. چوٿين انسٽار موت کي روڪڻ لاءِ مڇي جي ميل (0.5 ملي گرام في 300 لاروا) سان اضافي. پوءِ صرف مادين کي غير ليبل ٿيل نر سان ملن جي تجربن ۾ استعمال ڪيو ويو ته جيئن ملن دوران منتقل ٿيل نر پروٽوم جو تجزيو ڪيو وڃي.
4-6 ڏينهن جي عمر وارن 15N-ٽيگ ٿيل ڪنوارين عورتن کي عمر سان ملندڙ غير ٽيگ ٿيل ڪنوارين مردن سان ميلاپ ڪرڻ تي مجبور ڪيو ويو. ڪامياب ميلاپ جي تصديق ايپي فلوروسينس مائڪروسڪوپي تحت ميٽنگ پلگ کي ڳولڻ سان ڪئي وئي. 3، 12، ۽ 24 hpm تي، 45-55 ميٽ ٿيل عورتن جي ايٽريا کي 50 µl امونيم بائيڪاربونيٽ بفر (pH 7.8) ۾ ورهايو ويو ۽ هڪ پيسٽل سان هڪجهڙائي ڪئي وئي. هوموجنيٽ کي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ سپرنيٽينٽ کي 50 µl 0.1% ريپي گيسٽ (186001860، واٽر) سان 50 ايم ايم امونيم بائيڪاربونيٽ ۾ ملايو ويو. هر نموني مان سپرنيٽينٽ ۽ پيلٽ کي خشڪ برف تي سنيپ منجمد ڪيو ويو ۽ رات جو واشنگٽن يونيورسٽي ۾ ميڪ ڪاس ليبارٽري ڏانهن موڪليو ويو، جتي LC-MS/MS لاءِ نموني جي تياري مڪمل ڪئي وئي. پيلٽ کي 50 ايم ايم ۾ 0.1% ريپي گيسٽ جي 50 µl ۾ ٻيهر معطل ڪريو. امونيم بائي ڪاربونيٽ ۽ سونيڪٽ پاڻي جي غسل ۾. پيليٽ ۽ سپرنيٽنٽ جي پروٽين ڪنسنٽريشن کي BCA ايسي ذريعي ماپيو ويو، نمونن کي 5 ايم ايم ڊيٿيوٿريٽول (DTT؛ سگما) سان گھٽايو ويو، 15 ايم ايم آئيوڊواسيٽامائيڊ (سگما) سان الڪائليٽ ڪيو ويو ۽ ٽرائيپسنائيزيشن سان 1 ڪلاڪ لاءِ 37 °C (1:0 50) تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو: ٽرائيپسن: سبسٽريٽ تناسب). ريپي گيسٽ کي 200 ايم ايم ايڇ سي ايل جي اضافي سان لائيس ڪيو ويو، ان کان پوءِ 37 °C تي 45 منٽن لاءِ انڪيوبيشن ۽ ملبہ هٽائڻ لاءِ 4 °C تي 10 منٽن لاءِ 14,000 rpm تي سينٽرفيوگيشن ڪيو ويو. نمونن کي ڊبل موڊ سولڊ فيز ايڪسٽرڪشن (Oasis MCX ڪارٽريجز، واٽر) ذريعي ڌوئي ويو ۽ 0.33 µg µl-1 جي آخري پروٽين ڪنسنٽريشن لاءِ 0.1٪ فارمڪ ايسڊ ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو. غير ليبل ٿيل MAG پروٽوم کي ڪنوارن مردن مان ساڳئي طرح تجزيو ڪيو ويو.ٻن هر نموني لاءِ تجزياتي نقلن جو تجزيو ڪيو ويو. اڳتي هلي، هر هڪ جو 1 µg تجزيو ڪيو ويو 25 سينٽي ميٽر فيوز ٿيل سليڪا 75-μm ڪالم سان 4 سينٽي ميٽر فيوز ٿيل سليڪا ڪاسل 1 (PQ) فريٽ ٽريپ سان جيڪو Jupiter C12 ريورسڊ فيز رال (فينومينڪس) ۽ 180 منٽ مائع ڪروميٽوگرافي سان ڀريل هو. نموني ڊائجسٽ - MS/MS کي Q-Exactive HF ماس اسپيڪٽروميٽر (Thermo Fisher) تي نانو ACQUITY UPLC سسٽم (Waters) سان هلايو ويو. هر رن لاءِ ٺاهيل ڊيٽا سان لاڳاپيل حصول ڊيٽا کي پروٽووائزارڊ (ورژن 3.0.20287) استعمال ڪندي ۽ Comet31 (ورزن 3.2) استعمال ڪندي FASTA ڊيٽابيس جي خلاف mzML فارميٽ ۾ تبديل ڪيو ويو جنهن ۾ Anopheles gambiae (VectorBase version 54)، Anopheles coluzzi مان پروٽين جي ترتيب شامل هئي. Mali-NIH (VectorBase version 54)، Saccharomyces cerevisiae (Uniprot، مارچ 2021)، A. gambiae RNA-seq، ۽ ڄاڻايل انساني آلودگي جي ٽن فريم ترجمن تي ڳولا ڪئي وئي. پيپٽائڊ نقشي سان ملندڙ FDRs کي Percolator32 (ورزن 3.05) استعمال ڪندي 0.01 جي حد سان طئي ڪيو ويو، ۽ پيپٽائڊس کي پروٽين پارسيموني استعمال ڪندي پروٽين جي سڃاڻپ ۾ گڏ ڪيو ويو. لائم لائيٽ 33 (ورزن 2.2.0). هر رن ۾ هر پروٽين لاءِ حساب ڪيل نارملائيزڊ اسپيڪٽرل ابيوڊنسي فيڪٽر (NSAF) استعمال ڪندي نسبتي پروٽين جي ڪثرت جو اندازو لڳايو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي. هر پروٽين جي نسبت NSAF ٻن مختلف حياتياتي نقلن مان نمونن ۾ اوسط ڪيو ويو. 15N ليبلنگ ڪاميابي سان عورت پروٽيم کي نقاب پوش ڪيو، جيتوڻيڪ ليبل ٿيل ڪنوارين مان ٿوري مقدار ۾ غير ليبل ٿيل پروٽين ڳولي سگهجي ٿي. اسان صرف ٽيڪنيڪل رن ۾ عورت جي خام نمونن ۾ مرد پروٽين جي گهٽتائي (1-5 اسپيڪٽرا) جي ڳولا رڪارڊ ڪئي، جتي خام نمونا مرد/ملڻ وارن نمونن کان پوءِ هلايا ويا، HPLC "ڪيري اوور" جي نتيجي ۾. ليبل ٿيل ڪنوارين مان 'آلودگي' جي طور تي ڪڏهن ڪڏهن ملندڙ پروٽين ضمني جدول 1 ۾ درج ٿيل آهن.
جينسڪرپٽ ۾ ٻه اينٽيجنڪ پيپٽائڊس، QTTDRVAPAPDQQQ (آئسوٽائپ PA اندر) ۽ MESDGTTPSGDSEQ (آئسوٽائپ PA ۽ PB اندر). ٻن پيپٽائڊس کي گڏ ڪيو ويو، پوءِ ڪيريئر پروٽين KLH سان ملائي نيوزي لينڊ جي خرگوش ۾ داخل ڪيو ويو. چوٿين انجيڪشن کان پوءِ خرگوش کي قربان ڪيو ويو، ۽ ڪل IgG کي لاڳاپي جي صفائي ذريعي الڳ ڪيو ويو. سڀ کان وڌيڪ EPP مخصوص خرگوش مان IgG کي وڌيڪ مغربي بلوٽنگ لاءِ استعمال ڪيو ويو.
مغربي داغن لاءِ، MAG (n = 10، جتي n حياتياتي طور تي آزاد مڇر جي نمونن جي تعداد جي نمائندگي ڪري ٿو) ۽ مادي LRT (n = 30) 4 ڏينهن جي ڪنواري نر ۽ ڪنواري يا زبردستي ملائيندڙ مادي (<10 پوسٽ ميٽنگ) مان، پروٽين ڪڍڻ وارو بفر (50 mM Tris، pH 8.0؛ 1% NP-40؛ 0.25% سوڊيم ڊي آڪسيڪوليٽ؛ 150 mM NaCl؛ 1 mM EDTA؛ 1× پروٽيز انبيٽر ڪاڪٽيل (روشي)) الڳ الڳ شامل ڪيو ويو. نمونن کي بيڊر (2 mm گلاس بيڊز، 2,400 rpm، 90 سيڪنڊ) سان ڪٽڻ کان فوري طور تي هڪجهڙائي ڪئي وئي. غير حل ٿيندڙ ملبہ 20,000 گرام تي 4 °C تي سينٽرفيوگيشن ذريعي هٽايو ويو. پروٽين کي بريڊفورڊ ايسي (بائيو-ريڊ) ذريعي مقدار ۾ طئي ڪيو ويو. پوءِ، 20 µg MAG پروٽين، 40 µg LRT پروٽين، ۽ 20 µg باقي بچيل بلڪ پروٽين کي MOPS بفر استعمال ڪندي 10٪ Bis-Tris NuPAGE ذريعي ڊينيچر ڪيو ويو ۽ الڳ ڪيو ويو. پروٽين کي iBlot2 ٽرانسفر سسٽم (Thermo Fisher) استعمال ڪندي پولي ونائلائيڊين فلورائيڊ جھلي ڏانهن منتقل ڪيو ويو. جھليون 1× PBS-T (PBS ۾ 0.1٪ Tween-20) ۾ ٻه ڀيرا ڌوئيون ويون ۽ پوءِ 22°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ اوڊيسي بلاڪنگ بفر (Li-Cor) ۾ بلاڪ ڪيون ويون. جھليون رات جو 4 °C تي ڪسٽم خرگوش اينٽي-EPP پولي ڪلونل پرائمري اينٽي باڊي (بلاڪنگ بفر ۾ 1:700) ۽ چوٿون اينٽي-ايڪٽين مونوڪلونل پرائمري اينٽي باڊي MAC237 (Abeam؛ 1:4,000) سان هلايون ويون. جھليون PBS-T سان ڌوئي ويون ۽ پوءِ سيڪنڊري اينٽي باڊيز (گدائي اينٽي-خرگوش 800CW ۽ ٻڪري اينٽي-چوٿون 680LT (Li-Cor)، ٻئي 1:20,000) سان انڪيوبيٽ ڪيون ويون بلاڪنگ بفر ۾ جنهن ۾ 0.01% SDS ۽ 0.2٪ ٽوئن -20 1 ڪلاڪ لاءِ 22 °C تي. جھليون PBS-T سان ڌوئي ويون ۽ اوڊيسي CLx اسڪينر سان تصويرون ڪڍيون ويون. تصويرن کي تصويري اسٽوڊيو (ورژن 5.2) ۾ گڏ ڪيو ويو ۽ پروسيس ڪيو ويو. EPP-RA آئسفارم (82 kDa) سان لاڳاپيل هڪ مخصوص بينڊ نه مليو.
EPP جي ڪوڊنگ علائقن (جيئن آئسوفارم AGAP002463-RB جنهن ۾ هسٽيڊائن فاسفيٽيس ڊومين شامل آهي، NCBI محفوظ ڊومين ڳولا 34) ۽ EcK2 (AGAP002181) کي pET-21a(+) پلازمڊ (نوواجن مليپور سگما) ۾ ڪلون ڪيو ويو؛ پرائمر ايڪسٽينڊڊ ڊيٽا ٽيبل 2 ۾ درج ٿيل آهن. اٺ GS4 لنڪر (ٽينڊم ۾) pET-21a(+)-EcK2 ڪنسٽرڪٽ جي C-ٽرمينل 6xHis ٽيگ کان اڳ داخل ڪيا ويا. NEBExpress سيل-مفت E. coli پروٽين سنٿيسس ري ايڪشن (نيو انگلينڊ بايو ليبز) استعمال ڪندي ريڪومبيننٽ پروٽين پيدا ڪيا ويا. NEBExpress ني اسپن ڪالمن (نيو انگلينڊ بايو ليبز) استعمال ڪندي ريڪومبيننٽ پروٽين صاف ڪيا ويا. NEBExpress سيل-مفت E. coli پروٽين سنٿيسس ڪٽ مان ڊي اين اي ٽيمپليٽ استعمال ڪندي ڊائي هائيڊروفوليٽ ريڊڪٽيس (DHFR) ڪنٽرول پروٽين تيار ڪيو ويو. پروٽين کي PBS ۾ 50٪ گليسرول ۾ -20 °C تي 3 مهينن تائين محفوظ ڪيو ويو.
اي پي پي ۽ ٽشو ڪڍڻ جي فاسفيٽيز سرگرمي کي 4-نائيٽروفينائل فاسفيٽ (pNPP؛ سگما-الڊرچ) استعمال ڪندي ماپيو ويو. رد عمل بفر ۾ 25 ايم ايم ٽريس، 50 ايم ايم ايسٽڪ ايسڊ، 25 ايم ايم بِس-ٽريس، 150 ايم ايم NaCl، 0.1 ايم ايم اي ڊي ٽي اي، ۽ 1 ايم ايم ڊي ٽي ٽي شامل هئا. رد عمل بفر ۾ ٽشو کي هم جنس بڻايو ويو ۽ سيل ملبہ سينٽرفيوگيشن ذريعي هٽايو ويو. رد عمل شروع ڪريو اينزائم يا ٽشو ڪڍڻ کي رد عمل بفر ۾ شامل ڪندي جنهن ۾ 2.5 ايم جي ايم ايل-1 پي اين پي پي شامل آهي. رد عمل جو مرکب اونداهي ۾ ڪمري جي حرارت تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ۽ پي اين پي پي مان تبديل ٿيل پي اين پي جي مقدار کي مختلف وقتن تي 405 اين ايم تي جذب کي ماپڻ سان مقدار ۾ طئي ڪيو ويو.
ان ويٽرو اي سي ڪي سرگرمي لاءِ، پروٽين کي 0.2 ملي گرام 20E يا 3D20E سان 200 µl بفر (pH 7.5) ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو جنهن ۾ 10 mM HEPES-NaOH، 0.1% BSA، 2 mM ATP ۽ 10 mM MgCl2 شامل هئا 27 °C تي 2 ڪلاڪن لاءِ. رد عمل کي 800 µl ميٿانول شامل ڪري روڪيو ويو، پوءِ -20 °C تي 1 ڪلاڪ لاءِ ٿڌو ڪيو ويو، پوءِ 4 °C تي 10 منٽن لاءِ 20,000 g تي سينٽريفيوج ڪيو ويو. پوءِ سپرنيٽينٽ جو تجزيو HPLC-MS/MS پاران ڪيو ويو. ڪنٽرول گروپ ۾ استعمال ٿيندڙ پروٽين کي گرم ڪرڻ لاءِ، پروٽين کي 95 °C تي 20 منٽن لاءِ PBS ۾ 50% گليسرول ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو.
ان ويٽرو اي پي پي سرگرمي لاءِ، پروٽين کي 3D20E22P سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو (MAG جي 18 جوڙن ۾ مليل مقدار جي برابر، HPLC-MS/MS ذريعي پاڪ ڪيو ويو) 100 µl بفر (pH 7.5) ۾ جنهن ۾ 25 mM Tris، 50 mM acetic acid، 25 mM Bis-Tris، 150 mM NaCl، 0.1 mM EDTA، ۽ 1 mM DTT شامل هئا 27 °C تي 3 ڪلاڪن لاءِ. رد عمل کي 400 µl ميٿانول شامل ڪندي روڪيو ويو ۽ -20 °C تي 1 ڪلاڪ لاءِ ٿڌو ڪيو ويو، پوءِ 4 °C تي 10 منٽن لاءِ 20,000 g تي سينٽريفيوج ڪيو ويو. سپرنيٽينٽ جو تجزيو HPLC-MS/MS پاران ڪيو ويو.
EPP (362 bp)، EcK1 (AGAP004574، 365 bp) ۽ EcK2 (556 bp) لاءِ PCR ٽڪرا مخلوط جنس جي سر کان سواءِ مڇر جي لاشن مان تيار ڪيل cDNA مان وڌايل هئا. eGFP ڪنٽرول (495 bp) جو PCR ٽڪرو اڳ ۾ بيان ڪيل pCR2.1-eGFP مان وڌايل هو؛ پي سي آر پرائمر ايڪسٽينڊڊ ڊيٽا ٽيبل 2 ۾ درج ٿيل آهن. پي سي آر ٽڪرو pL4440 پلازمڊ تي الٽي ٿيل T7 پروموٽرز جي وچ ۾ داخل ڪيو ويو. پلازمڊ ڪنسٽرڪٽس NEB 5-α قابل اي ڪولي (نيو انگلينڊ بايولابس) مان هٿ ڪيا ويا ۽ استعمال کان اڳ ڊي اين اي سيڪوئنسنگ ذريعي تصديق ڪئي وئي (انسرٽ سيڪوئنس لاءِ ضمني ڊيٽا 1 ڏسو). T7 پروموٽر (ايڪسٽينڊڊ ڊيٽا ٽيبل 2) سان ملندڙ پرائمر pL4440 تي ٻڌل پلازمڊ مان انسرٽ کي وڌائڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا. پي سي آر پراڊڪٽ جي سائيز جي تصديق ايگاروز جيل اليڪٽروفورسس ذريعي ڪئي وئي. ڊي ايس آر اين اي کي ميگا اسڪرپٽ T7 ٽرانسڪرپشن ڪٽ (ٿرمو فشر) استعمال ڪندي پي سي آر ٽيمپليٽس مان نقل ڪيو ويو ۽ اڳ ۾ بيان ڪيل تبديلين سان ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق صاف ڪيو ويو.
dsRNA انجيڪشن لاءِ، 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) کي ايڪلوشن کان پوءِ 1 ڏينهن اندر بالغ نر يا مادي (Nanoject III, Drummond) جي سيني ۾ 10 ng nl-1 جي ڪنسنٽريشن تي انجيڪٽ ڪيو ويو. جين جي ناڪ ڊائون جي سطح گهٽ ۾ گهٽ ٽن حياتياتي نقلن ۾ RNA ڪڍڻ، cDNA سنٿيسس، ۽ RT-qPCR ذريعي طئي ڪئي وئي. ecdysone انجيڪشن لاءِ، 4 ڏينهن جي ڪنواري يا 6 ڏينهن جي ڪنواري رت پيئندڙ عورتن کي 0.13، 0.21، يا 0.63 µg 20E يا 3D20E (Nanoject III, Drummond) سان ترتيب وار 1.3، 2.1 جي ڪنسنٽريشن تي انجيڪٽ ڪيو ويو، تجرباتي ڊيزائن يا 6.3 ng nl-1 تي منحصر آهي. 100 nl 10٪ (vol/vol) جو انجيڪٽ ڪريو. پاڻيءَ ۾ ايٿانول؛ 10٪ ايٿانول ۾ 3D20E22P جو 100 nl (MAGs جي هڪ جوڙي ۾ مليل مقدار جي 75٪ جي برابر). مڇرن کي بي ترتيب طور تي انجيڪشن گروپ ۾ مقرر ڪيو ويو.
اسپوننگ ٽيسٽ لاءِ، 3 ڏينهن جي مادين کي انساني رت تي مفت کارايو ويو. جزوي طور تي کارايل يا غير کارايل مڇرن کي هٽايو. علاج جي بنياد تي، مادين کي رت جي کائڻ کان گهٽ ۾ گهٽ 48 ڪلاڪن لاءِ چار راتيون الڳ اسپوننگ پيالن ۾ رکيو ويو. انڊن کي اسٽيريو اسڪوپ (اسٽيمي 508، زيس) هيٺ ڳڻيو ويو؛ ملائي مادين لاءِ، اهي آنا جيڪي لاروا ۾ نڪتا هئا انهن کي زرخيز سمجهيو ويندو هو.
ميٽنگ جي آزمائشن لاءِ، عورتن کي علاج جي لحاظ کان گهٽ ۾ گهٽ 2 ڏينهن جي اجازت ڏني وئي ته جيئن ملن جي مزاحمت پيدا ٿئي، ۽ جهنگلي قسم جي عمر سان ملندڙ نر بعد ۾ ساڳئي پنجري ۾ متعارف ڪرايا ويا. ٻن راتين کان پوءِ، مادي ڀاڻ واري ويسڪلز کي ڪٽيو ويو ۽ جينومڪ ڊي اين اي کي فريز-ٿاؤ ۽ سونيڪيشن ذريعي هڪ بفر ۾ جاري ڪيو ويو جنهن ۾ 10 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل، 1 ايم ايم اي ڊي ٽي اي، ۽ 25 ايم ايم اين اي سي ايل (پي ايڇ 8.2) شامل هئا. نمونن کي پروٽينيس ڪي (0.86 µg µl-1) سان 55 °C تي 15 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ان کان پوءِ 95 °C تي 10 منٽ. خام جينومڪ ڊي اين اي تيارين کي 10 ڀيرا گھٽايو ويو ۽ Y ڪروموزوم تسلسل جي qPCR جي سڃاڻپ جي تابع ڪيو ويو؛ پرائمر وڌايل ڊيٽا ٽيبل 2 ۾ درج ٿيل آهن. Y ڪروموزوم تسلسل جي غير موجودگي ڪنهن به ميلاپ جي نشاندهي ڪري ٿي.
ٻيهر ميٽنگ ٽيسٽ لاءِ، فورس ميٽ ٿيل عورتن کي ميٽنگ پلگ جي موجودگي لاءِ جانچيو ويو ته جيئن ميٽنگ جي حيثيت جي تصديق ڪري سگهجي ۽ نر جي غير موجودگي ۾ ميٽنگ لاءِ ريفريڪٽورينس پيدا ڪرڻ لاءِ 2 ڏينهن جي اجازت ڏني وئي، جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي 36. DsRed ٽرانسجينڪ اسپرم کڻندڙ نر پوءِ مادي پنجرن ۾ متعارف ڪرايا ويا. ٻن راتين کان پوءِ، مادين مان ڀاڻ ڏيندڙ ويسڪلز کي الڳ ڪيو ويو، ۽ جينومڪ ڊي اين اي تيار ڪيو ويو جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي ۽ DsRed ٽرانسجين جي qPCR جي سڃاڻپ جي تابع ڪيو ويو؛ پرائمر وڌايل ڊيٽا ٽيبل 2 ۾ درج ٿيل آهن. DsRed ٽرانسجين جي غير موجودگي ظاهر ڪيو ته ڪو به ٻيهر ميٽنگ نه ٿيو.
3D20E کي اڳ ۾ بيان ڪيل 37 مطابق سنٿيسائز ڪيو ويو. مختصر طور تي، 10 ملي گرام 20E (سگما-الڊرچ) کي 10 ملي ليٽر پاڻي ۾ حل ڪيو ويو، ان کان پوءِ 30 ملي گرام پلاٽينم ڪارو (پاؤڊر جي صورت ۾، سگما-الڊرچ) شامل ڪيو ويو. رد عمل جي مرکب ۾ O2 جو هڪ نرم وهڪرو مسلسل بلبل ڪيو ويو، جيڪو ڪمري جي حرارت تي هلايو ويو. 6 ڪلاڪن کان پوءِ، رد عمل کي روڪڻ لاءِ 30 ملي ليٽر ميٿانول شامل ڪيو ويو. ڪيٽالسٽ ذرات کي هٽائڻ لاءِ مرکب کي سينٽرفيوج ڪيو ويو. سپرنيٽينٽ کي ڪمري جي حرارت تي ويڪيوم ۾ خشڪ ٿيڻ لاءِ بخارات بڻايو ويو. خشڪ رد عمل جي پيداوار کي HPLC-MS/MS تجزيي لاءِ انجيڪشن لاءِ 10٪ ايٿانول ۽ ميٿانول ۾ حل ڪيو ويو. تبديلي جي شرح (20E کان 3D20E تائين) تقريبن 97٪ هئي (شڪل 4b)، ۽ سنٿيسائز ٿيل 3D20E جو MS اسپيڪٽرم ملائيل عورتن ۾ مليو (شڪل 4c).
ليجنڊ ۾ ڪيل شمارياتي ٽيسٽن جا مخصوص تفصيل شامل آهن. گراف پيڊ (ورژن 9.0) فشر جي صحيح ٽيسٽ، مينٽيل-ڪاڪس ٽيسٽ، ۽ شاگرد جي ٽي-ٽيسٽ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. ڪوچران-مينٽيل-هائينزل ٽيسٽ هڪ ڪسٽم آر اسڪرپٽ استعمال ڪندي ڪيا ويا (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test تي دستياب آهي). ڊيٽا جي ورڇ کي 0.05 جي اهميت جي حد سان Shapiro-Wilk ٽيسٽ استعمال ڪندي نارملٽي لاءِ جانچيو ويو. جڏهن ڊيٽا نارملٽي ٽيسٽ ۾ ناڪام ٿيو، ته Mann-Whitney ٽيسٽ ڪيو ويو. بقا جي ڊيٽا جو تجزيو مينٽيل-ڪاڪس ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. DESeq2 پيڪيج (ورزن 1.28.1) RNA-seq جين-سطح جي فرق جي اظهار جي تجزيو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. گراف تي افقي بار وچين جي نمائندگي ڪري ٿو. P = 0.05 جي اهميت جي قيمت سڀني ٽيسٽن لاءِ حد طور استعمال ڪئي وئي.
مطالعي جي ڊيزائن بابت وڌيڪ معلومات لاءِ، هن مضمون سان ڳنڍيل نيچر ريسرچ رپورٽ جو خلاصو ڏسو.
ايم ايس پروٽومڪ ڊيٽا کي ڊيٽا سيٽ سڃاڻپ ڪندڙ PXD032157 سان PRIDE پارٽنر ريپوزٽري (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ذريعي پروٽيو ايڪسچينج ڪنسورشيم (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ۾ جمع ڪرايو ويو.
آر اين اي-سيڪ ڊيٽا سيٽ سيريل رڪارڊ GSE198665 تحت جين ايڪسپريشن ڪامپريهينسو لائبريري (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ۾ جمع ڪيو ويو آهي.
موجوده مطالعي دوران ٺاهيل ۽/يا تجزيو ڪيل اضافي ڊيٽاسيٽ لاڳاپيل ليکڪن کان مناسب درخواست تي حاصل ڪري سگهجن ٿا. هي مضمون ذريعو ڊيٽا فراهم ڪري ٿو.
ڊي لوف، اي. ايڪڊيسٽرائڊس: نظرانداز ڪيل ڪيڙن جي جنسي اسٽيرائڊس؟ مرد: بليڪ باڪس. ڪيڙن جي سائنس. 13، 325-338 (2006).
ريڊفرن، سي پي ايف 20-هائيڊروڪسي ايڪڊيسون ۽ اينوفيلس اسٽيفنز ۾ رحم جي ترقي. جي. انسڪٽ فزيالوجي. 28، 97-109 (1982).