سيل ڪمپارٽمينٽلائيزيشن ۽ هوميوسٽاسس کي برقرار رکڻ لاءِ سيڪريٽري رستي ۾ پروٽين جي ترتيب ضروري آهي. شيل-ميڊيئيٽيڊ ترتيب کان علاوه، سيڪريٽري ٽرانسپورٽ جي عمل ۾ ڪائنسين ترتيب ۾ لپڊس جو ڪردار هڪ ڊگهي عرصي کان هلندڙ بنيادي سوال آهي جنهن جو اڃا تائين جواب نه ڏنو ويو آهي. هتي، اسان 3D هڪ ئي وقت ملٽي ڪلر هاءِ ريزوليوشن ريئل ٽائيم اميجنگ ڪندا آهيون ته جيئن ان وييو ۾ ثابت ٿئي ته نئين ٺهيل گلائڪوسيلفاسفٽيڊيلينوسائٽول-اموبلائيزڊ پروٽين تمام ڊگهي سيرامائيڊ لپڊ موئيٽيز سان ڪلسٽر ٿيل آهن ۽ خاص اينڊوپلاسمز نيٽ ايگزٽ سائيٽ ۾ درجه بندي ڪيا ويا آهن، جيڪو ٽرانس ميمبرين پروٽين پاران استعمال ٿيندڙ کان مختلف آهي. ان کان علاوه، اسان ڏيکاريون ٿا ته اينڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم جھلي ۾ سيرامائيڊ جي زنجير جي ڊيگهه هن ترتيب ڏيڻ جي چونڊ لاءِ اهم آهي. اسان جو مطالعو پهريون سڌو ان وييو ثبوت فراهم ڪري ٿو ته پروٽين ڪارگوز کي لپڊ چين جي ڊيگهه جي بنياد تي سيڪريٽري رستي ۾ چونڊيل برآمد سائيٽن ۾ درجه بندي ڪيو وڃي.
يوڪريوٽڪ سيلز ۾، اينڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم (ER) ۾ ٺهيل پروٽين کي پوءِ ٽرانسپورٽ دوران سيڪريٽري رستي ذريعي ترتيب ڏنو ويندو آهي ته جيئن انهن جي مناسب سيلولر منزل تائين پهچايو وڃي (1). ڪوٽ-ميڊيئيٽڊ ترتيب ڏيڻ کان علاوه، اهو ڊگهي عرصي کان اندازو لڳايو ويو هو ته ڪجهه لپڊ پڻ چونڊيل نڪرڻ واري پوائنٽن جي طور تي ڪم ڪري سگهن ٿا انهن کي مخصوص جھلي ڊومينز ۾ ڪلسٽر ڪندي جيڪي مخصوص پروٽين (2-5). تنهن هوندي، هن ممڪن لپڊ تي ٻڌل ميڪانيزم کي ثابت ڪرڻ لاءِ اڃا تائين سڌي طرح ان ويوو ثبوت جي کوٽ آهي. هن بنيادي مسئلي کي حل ڪرڻ لاءِ، اسان خمير ۾ مطالعو ڪيو ته ڪيئن گلائڪوسيلفاسفٽيڊيلينوسائٽول (GPI) اينڪرڊ پروٽين (GPI-APs) ER مان مختلف طور تي برآمد ڪيا ويندا آهن. GPI-APs لپڊ سان ڳنڍيل سيل مٿاڇري پروٽين جي هڪ قسم آهن (6، 7). GPI-AP هڪ سيڪريٽ پروٽين آهي جيڪو پلازما جھلي جي ٻاهرين ليفليٽس سان گلائڪوليپڊ موئيٽي (GPI اينڪر) ذريعي ڳنڍيل آهي. اهي GPI اينڪرز کي ER لومين ۾ قدامت پسند پوسٽ-ٽرانسليشنل تبديلين جي طور تي قبول ڪن ٿا (8). ڳنڍڻ کان پوءِ، GPI-AP گولگي اپريٽس (5، 9) ذريعي ER کان پلازما جھلي تائين گذري ٿو. GPI اينڪرز جي موجودگي GPI-AP کي ٽرانسميمبرن سيڪريٽڊ پروٽين (ٻين پلازما جھلي پروٽين سميت) کان الڳ طور تي سيڪريٽري رستي (5، 9، 10) سان منتقل ڪرڻ جو سبب بڻائيندو آهي. خمير جي سيلن ۾، GPI-APs کي اينڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم ۾ ٻين سيڪريٽڊ پروٽين کان الڳ ڪيو ويندو آهي، ۽ پوءِ ڪوٽ پروٽين ڪمپليڪس II (COPII) (6، 7) ذريعي لپيٽيل منفرد ويسڪلز ۾ پيڪ ڪيو ويندو آهي. ER برآمد جي عمل ۾ هن درجه بندي جي عمل جا تعين ڪندڙ واضح نه آهن، پر اهو اندازو لڳايو ويو آهي ته هن ميڪانيزم کي لپڊس جي ضرورت ٿي سگهي ٿي، خاص طور تي GPI اينڪر جي لپڊ حصي جي ساخت جي ريموڊلنگ (5، 8). خمير ۾، GPI لپڊ ريموڊلنگ GPI جي ڳنڍڻ کان فوري طور تي شروع ٿئي ٿي، ۽ ڪيترن ئي ڪيسن ۾، اهو سيرامائيڊ کي 26-ڪاربن لانگ-چين سيچوريٽريڊ فيٽي ايسڊ (C26:0) (11، 12) سان ڳنڍڻ جو سبب بڻائيندو آهي. C26 سيرامائيڊ هاڻي تائين خمير جي سيلن پاران پيدا ٿيندڙ مکيه سيرامائيڊ آهي. اهو ER ۾ ٺهيل آهي ۽ ان جو گهڻو حصو COPII ويسڪلز (13) ذريعي گولگي اپريٽس ڏانهن برآمد ڪيو ويندو آهي. GPI-AP جي ER برآمد لاءِ خاص طور تي جاري سيرامائيڊ سنٿيسس (14، 15) جي ضرورت آهي، ۽ ان جي نتيجي ۾، گولگي اپريٽس ۾ سيرامائيڊ کي انوسٽول فاسفيٽ سيرامائيڊ (IPC) ۾ تبديل ڪرڻ GPI اينڪر سنٿيسس (16) تي منحصر آهي. مصنوعي جھلي سان بايو فزيڪل مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته تمام ڊگھا ايسل چين سيرامائيڊ منفرد جسماني خاصيتن سان ترتيب ڏنل ڊومين ٺاهڻ لاءِ گڏ ٿي سگهن ٿا (17، 18). اهي ڊيٽا هن مفروضي ڏانهن وٺي وڃن ٿا ته C26 سيرامائيڊ ۽ GPI-AP C26 سيرامائيڊ سان گڏ انهن جي جسماني خاصيتن کي استعمال ڪندي نسبتا گندي ER جھلي لپڊ ماحول ۾ ترتيب ڏنل علائقن يا علائقن ۾ گڏ ٿين ٿا. اهو بنيادي طور تي مختصر ۽ غير مطمئن گليسرولپڊس (C16:1 ۽ C18:1) (19، 20) تي مشتمل آهي. انهن علائقن کي چونڊيل طور تي مخصوص ER ايگزٽ سائيٽن (ERES) تي ڌيان ڏنو ويندو، جتي سيرامائيڊ ۽ سيرامائيڊ تي ٻڌل GPI-AP کي ساڳئي وقف ٿيل COPII ويسيڪل (5) ۾ گولگي ڏانهن منتقل ڪري سگهجي ٿو.
هن مطالعي ۾، اسان سڌو سنئون هن لپڊ تي ٻڌل ميڪانيزم کي سپر ريزوليوشن ڪنفوڪل ريئل ٽائيم اميجنگ مائڪروسڪوپي (SCLIM) استعمال ڪندي آزمايو آهي، جيڪو هڪ جديد مائڪروسڪوپي ٽيڪنڪ آهي جيڪو هڪ ئي وقت فلوروسينٽلي ليبل ٿيل پروٽين جو مشاهدو ڪري سگهي ٿو. ٽي رنگ ۽ ٽي-dimensional (3D) تصويرون زنده سيلن ۾ انتهائي اعليٰ ريزوليوشن ۽ رفتار رکن ٿيون (21، 22).
اسان پهريون ڀيرو SCLIM ٽيڪنالاجي لاڳو ڪئي ته ڪيئن عام GPI-AP سان C26 سيرامائيڊ گروپ کي S. cerevisiae ۾ ER ڇڏڻ کان پوءِ ٽرانسميمبرين سيڪريٽڊ پروٽين مان اسڪرين ڪيو ويو. ER جي درجه بندي کي جانچڻ لاءِ، اسان هڪ جينياتي نظام استعمال ڪيو جيڪو سڌو سنئون ERES ۾ داخل ٿيندڙ نئين ٺهيل ڪارگو کي تصور ڪري سگهي ٿو (7، 23). ڪارگو جي طور تي، اسان C26 سيرامائيڊ تي ٻڌل GPI-AP گيس 1 کي چونڊيو جيڪو گرين فلوروسينٽ پروٽين (GFP) سان ليبل ٿيل آهي ۽ ٽرانسميمبرين سيڪريٽڊ پروٽين Mid2 کي ويجھو انفراريڊ فلوروسينٽ پروٽين (iRFP) سان ليبل ٿيل آهي، جيڪي ٻئي پلازما جھلي کي نشانو بڻائين ٿا (24-26). sec31-1 گرمي پد جي حساس ميوٽنٽ ۾، اهي ٻئي ڪارگو هڪ گليڪٽوز-انڊيڪيبل پروموٽر ۽ هڪ آئيني ERES مارڪر جي تحت ظاهر ڪيا ويا آهن. انتهائي گرمي پد (37°C) تي، ڇاڪاڻ ته sec31-1 ميوٽيشن COPII ڪوٽ جزو Sec31 جي ڪم کي متاثر ڪري ٿو ته جيئن COPII جي ڄمڻ ۽ ER برآمد کي روڪي سگهجي، نئون ٺهيل ڪارگو ER تي جمع ٿئي ٿو (23). گهٽ درجه حرارت (24 ° C) تي ٿڌو ٿيڻ کان پوءِ، sec31-1 ميوٽنٽ سيلز سيڪريٽري ايريا مان بحال ٿيا، ۽ گڏ ٿيل نئون مصنوعي ڪارگو ER مان برآمد ٿيڻ شروع ٿيو. CLIM ويزوئلائيزيشن ڏيکاريو ته گھڻا نوان ٺهيل Gas1-GFP ۽ Mid2-iRFP اڃا تائين sec31-1 ميوٽنٽ سيلز جي ER ۾ 37 ° C تي انڪيوبيشن کان پوءِ گڏ ٿيا ۽ پوءِ 24 ° C تي 5 منٽن لاءِ ڇڏيا ويا (شڪل 1). جيئن ته Mid2-iRFP پوري ER جھلي تي ورهايل آهي، ۽ Gas1-GFP مرڪوز آهي ۽ بي ترتيب ER جھلي واري علائقي ۾ گڏ ٿيل آهي، انهن جي ورڇ مڪمل طور تي مختلف آهي (شڪل 1، A کان C ۽ مووي S1). ان کان علاوه، جيئن شڪل 1D ۾ ڏيکاريل آهي، Gas1-GFP ڪلسٽر ۾ Mid2-iRFP ناهي. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته GPI-AP ۽ ٽرانسميمبرين پروٽين کي مختلف ER جھلي وارن علائقن ۾ جلد الڳ ڪيو ويو هو. گيس 1-GFP ڪلسٽر هڪ مخصوص ERES جي ڀرسان آهي جنهن تي mCherry جي COPII ڪوٽ پروٽين Sec13 (شڪل 1، E ۽ F، ۽ فلم S1) (23) سان ليبل ٿيل آهي.
sec31-1 سيلز گليڪٽوز-حوصلہ افزائي رطوبت، هڪ ڊگهو ايسل چين (C26) سيرامائيڊ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP، سائو) ۽ ٽرانسميمبرين پروٽين Mid2-iRFP (TMP، نيرو) ظاهر ڪن ٿا ۽ هي تعميري ERES ليبلنگ Sec13-mCherry (ERES، ميجنٽا) کي 30 منٽن لاءِ 37°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو، 24°C تي منتقل ڪيو ويو، ۽ 5 منٽن بعد SCLIM پاران تصوير ڪئي وئي. (A کان C) هڪ جهاز (A) جي هڪ نمائندگي ڪندڙ ضم ٿيل يا سنگل 2D تصوير، 10 z-سيڪشن (B) جي 2D پروجئشن تصوير يا ڪارگو ۽ ERES مارڪرز (C) جي 3D سيل هيمسفير تصوير ڏيکاري ٿو. اسڪيل بار 1μm (A ۽ B). اسڪيل يونٽ 0.551μm (C) آهي. Gas1-GFP کي ڊسڪريٽ ER علائقن يا ڪلسٽرن ۾ ڳولهيو ويو، جڏهن ته Mid2-iRFP کي ڳولهيو ويو ۽ سڄي ER جھلي (C) ۾ ورهايو ويو. (ڊي) گراف گيس 1-GFP ڪلسٽر ۾ سفيد تير جي لڪير (کاٻي پاسي) سان گڏ گيس 1-GFP ۽ مڊ 2-iRFP جي نسبتي فلوروسينس شدت ڏيکاري ٿو. AU، صوابديدي يونٽ. (E ۽ F) 3D تصوير جي نمائندگي ڪن ٿا جيڪا سامان ۽ ERES نشان کي گڏ ڪري ٿي. گيس 1-GFP ڪلسٽر مخصوص ERES جي ويجهو ڳوليا ويا. اسڪيل يونٽ 0.551μm آهي. (F) اڇو مضبوط تير ERES سان لاڳاپيل گيس 1-GFP ڪلسٽر کي نشانو بڻائيندو آهي. وچين ۽ ساڄي پينل ضم ٿيل وڌايل 3D تصوير ۽ چونڊيل گيس 1-GFP ڪلسٽر جو گھميل نظارو ڏيکارين ٿا.
Gas1-GFP ڪلسٽر ۽ هڪ مخصوص ERES جي وچ ۾ ويجهي فضائي تعلق ظاهر ڪري ٿو ته Gas1-GFP چونڊيل ERES ۾ داخل ٿي سگهي ٿو، جيڪو ER ڇڏڻ لاءِ Mid2-iRFP پاران استعمال ٿيندڙ چونڊ کان مختلف آهي. هن امڪان کي حل ڪرڻ لاءِ، اسان صرف هڪ يا ٻن شين لاءِ ERES تناسب جو اندازو لڳايو (شڪل 2، A کان C). اسان ڏٺو ته گهڻا ERES (70٪) صرف هڪ قسم جو ڪارگو تي مشتمل آهن. شڪل 2C جي هيٺئين تصوير صرف Gas1-GFP (شڪل 1) يا صرف Mid2-iRFP (شڪل 2) سان ERES جا ٻه عام مثال ڏيکاري ٿي. ان جي ابتڙ، تقريبن 20٪ ERES ۾ ٻه ڪارگو شامل آهن جيڪي ساڳئي علائقي ۾ اوورليپ ٿين ٿا. اهو مليو ته ڪجهه ERES (10٪) ۾ ٻه قسم جا ڪارگو شامل هئا، پر اهي واضح طور تي مختلف علائقن ۾ الڳ ٿيل هئا. تنهن ڪري، هي شمارياتي تجزيو ڏيکاري ٿو ته ER برآمد ٿيڻ کان پوءِ، GPI-AP Gas1-GFP ۽ ٽرانس ميمبرين ڪارگو Mid2-iRFP مختلف ERES ۾ ورهايل آهن (شڪل 2D). هي ترتيب ڏيڻ جي ڪارڪردگي پوئين بايو ڪيميڪل تجزيو (6) ۽ مورفولوجيڪل تعين (7) سان تمام گهڻي مطابقت رکي ٿي. اسان ERES ۾ داخل ٿيندڙ قرنطين ٿيل ڪارگو جي رويي جو پڻ مشاهدو ڪري سگهون ٿا (شڪل 2E ۽ مووي S2). شڪل 2E ڏيکاري ٿو ته Gas1-GFP (پينل 3) يا Mid2-iRFP (پينل 4) جو صرف هڪ ننڍڙو حصو ERES ۾ هڪ پاسي کان داخل ٿئي ٿو ۽ هڪ الڳ علائقي ۾ محدود آهي. شڪل 2E جو پينل 5 ڏيکاري ٿو ته Gas1-GFP ۽ Mid2-iRFP ڪڏهن ڪڏهن ساڳئي ERES ۾ مليا آهن، پر اهي مختلف پاسن کان داخل ٿين ٿا ۽ الڳ الڳ علائقن ۾ مرڪوز آهن جيڪي مختلف COPII ويسڪلز جي نمائندگي ڪري سگهن ٿا. اسان اهو پڻ تصديق ڪئي ته C26 سيرامائيڊ تي ٻڌل GPI-AP Gas1 جي چونڊيل ERES جي طور تي مشاهدو ڪيل علحدگي ۽ درجه بندي مخصوص آهي ڇاڪاڻ ته هڪ ٻيو ٽرانسميمبرين سيڪريشن ڪارگو، GFP-ٽيگ ٿيل پلازما ميمبرين پروٽين Axl2 (27)، Mid2-iRFP سان ملندڙ جلندڙ رويي ڏيکاري ٿو. (تصوير S1 ۽ مووي S3). نئون ٺهيل Axl2-GFP ER جھلي ذريعي ورهايو ويندو آهي جهڙوڪ Mid2-iRFP (شڪل S1، A ۽ B)، ۽ گھڻن ERES ۾ Mid2-iRFP سان گڏ مقامي ڪيو ويندو آهي (شڪل S1، B کان D). شڪل 1 جا پينل 1 ۽ 2. S1C ERES جا ٻه عام مثال ڏيکاري ٿو جتي ٻه ٽرانس ميمبرين ڪارگو اوورليپ ٿين ٿا. انهن حالتن ۾، ٻئي سامان گڏجي ERES ۾ داخل ٿين ٿا (شڪل S1E، پينل 3 ۽ مووي S3).
sec31-1 سيلز جيڪي گليڪٽوز انڊيڪيبل رطوبتن جو اظهار ڪن ٿا، Gas1-GFP (GPI-AP، سائو) ۽ Mid2-iRFP (TMP، نيرو) ۽ Sec13-mCherry (ERES، ميجنٽا) جي ليبلنگ ڪنسٽيٽيو ERES کي 37 تي رکيو ويو °C تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪرڻ کان پوءِ، secretion بلاڪ کي ڇڏڻ لاءِ 24 °C تي منتقل ڪريو، ۽ 20 منٽن کان پوءِ SCLIM سان تصوير ڪڍو. (A کان C) ڪارگو جي نمائندگي ڪندڙ 2D پروجئشن تصويرون (A؛ اسڪيل بار، 1μm) يا 3D سيل هيمسفير تصويرون (B ۽ C؛ اسڪيل يونٽ، 0.456μm) ۽ ERES پاران نشان لڳل 10 z-سيڪشن. (B) ۾ هيٺيون پينل ۽ (C) ۾ پينل صرف ERES (ميجنٽا) ۾ موجود سامان کي ڏيکارڻ لاءِ پروسيس ٿيل تصويرون ڏيکاري ٿو [Gas1-GFP (گرين) ۽ Mid2-iRFP (هلڪو نيرو)]. (ج) کليل تير: ERES صرف هڪ سامان کڻندو آهي (1 کان 4). گرين تير: ERES ۾ الڳ ٿيل سامان شامل آهي (5). اڇو مضبوط تير: ERES ۾ گڏيل طور تي واقع سامان شامل آهي. هيٺ ڏنل: چونڊيل واحد ERES ۾ صرف Gas1-GFP (1) يا Mid2-iRFP (2) شامل آهي. اسڪيل بار، 100 nm. (د) (سي) ۾ بيان ڪيل فوٽو مائڪروگراف جي مقدار. ERES جو سراسري سيڪڙو جنهن ۾ صرف هڪ سامان شامل آهي (گيس1-GFP يا Mid2-iRFP)، الڳ ٿيل سامان ۽ اوورليپنگ سامان. ٽن آزاد تجربن ۾، 54 سيلن ۾ n=432. غلطي بار = SD. ٻه-ٽيل غير جوڙيل ٽي ٽيسٽ. *** P = 0.0002. (اي) (سي) سان نشان لڳل قرنطين ٿيل سامان جي چونڊيل ERES جي 3D تصوير. Gas1-GFP (سائي) (3) يا Mid2-iRFP (نيرو) (4) هڪ پاسي کان ERES (ميجنٽا) ۾ داخل ٿئي ٿو ۽ ERES اندر هڪ ننڍڙي علائقي تائين محدود آهي. ڪڏهن ڪڏهن، ٻنهي قسمن جو سامان ساڳئي پاسي کان ساڳئي ERES (5) ۾ داخل ٿئي ٿو ۽ ERES اندر هڪ الڳ ٿيل علائقي تائين محدود آهي. اسڪيل بار، 100 nm.
اڳيون، اسان هڪ مفروضي جي جانچ ڪئي ته ER جھلي ۾ موجود ڊگهو ايسل چين سيرامائيڊ (C26) گيس 1 جي مخصوص ڪلسٽرنگ ۽ ترتيب کي چونڊيل ERES ۾ هلائي ٿو. ان مقصد لاءِ، اسان هڪ تبديل ٿيل خميري اسٽرين GhLag1 استعمال ڪيو، جنهن ۾ ٻه اينڊوجينس سيرامائيڊ سنٿيسس Lag1 ۽ Lac1 کي GhLag1 (ڪپهه جو Lag1 هومولوگ) سان تبديل ڪيو ويو، جنهن جي نتيجي ۾ هڪ خميري اسٽرين هڪ سيل جھلي سان سيرامائيڊ اسٽرين جهنگلي قسم کان ننڍو (شڪل 3A) (28). ماس اسپيڪٽروميٽري (MS) تجزيي مان ظاهر ٿيو ته جهنگلي قسم جي اسٽرين ۾، ڪل سيرامائيڊ جو 95٪ تمام ڊگهو (C26) زنجير سيرامائيڊ آهي، جڏهن ته GhLag1 ۾، سيرامائيڊ جو 85٪ تمام ڊگهو (C18 ۽ C16) آهي. )، سيرامائيڊ جو صرف 2٪ تمام ڊگهو (C26) زنجير سيرامائيڊ آهي. جيتوڻيڪ C18 ۽ C16 سيرامائڊ GhLag1 جھلي ۾ هاڻي تائين ڳوليل مکيه سيرامائڊ آهن، MS تجزيي پڻ تصديق ڪئي ته GhLag1 اسٽرين ۾ ظاهر ڪيل Gas1-GFP جي GPI اينڪر ۾ C26 سيرامائڊ شامل آهي، جيڪو جهنگلي قسم جي لپڊس سان مقابلو ڪري سگهجي ٿو. معيار ساڳيو آهي (شڪل 3A) (26). تنهن ڪري، ان جو مطلب اهو آهي ته سيرامائڊ ريموڊلنگ اينزائم Cwh43 C26 سيرامائڊ لاءِ انتهائي چونڊيل آهي، جيئن شڪل 26 ۾ ڏيکاريل آهي، اهو ترجيحي طور تي GhLag1 اسٽرين ۾ C26 سيرامائڊ جي ٿوري مقدار مان GPI اينڪر کي شامل ڪري ٿو. S2 (29). تنهن هوندي به، GhLag1 جي سيل جھلي ۾ بنيادي طور تي صرف C18-C16 سيرامائڊ شامل آهي، جڏهن ته Gas1-GFP ۾ اڃا تائين C26 سيرامائڊ آهي. هي حقيقت هن اسٽرين کي ER ۾ جھلي سيرامائڊ جي ايسيل چين جي ڊيگهه جي مسئلي کي حل ڪرڻ لاءِ هڪ مثالي اوزار بڻائي ٿي. ڪلاس ۽ ترتيب ڏيڻ جو فرضي ڪردار. پوءِ، اسان پهريون ڀيرو روايتي فلوروسينس مائڪروسڪوپي ذريعي sec31-1 جي گرمي پد جي حساس ميوٽنٽ ايليل سان GhLag1 ۾ ڪلسٽرن ۾ گڏ ٿيڻ جي C26 Gas1-GFP جي صلاحيت جو مطالعو ڪيو، جتي صرف ڊگهو (C18-C16) زنجير ER جھلي Ceramide (شڪل 3) ۾ موجود آهي. اسان ڏٺو ته sec31-1 ۾، گهڻو ڪري Gas1-GFP ڪلسٽرن ۾ مرڪوز هو، جڏهن ته sec31-1 GhLag1 ۾ ڊگهو (C18-C16) ڊگهو سيرامائيڊ ER جھلي سان Gas1-GFP بنيادي طور تي ڪلسٽر نه ڪيو ويو ۽ پوري ER جھلي ۾ ورهايو ويو. صحيح هجڻ لاءِ، ڇاڪاڻ ته C26 سيرامائيڊ تي ٻڌل ڪلسٽرنگ مخصوص ERES (شڪل 1) سان ويجهي سان لاڳاپيل آهي، اسان اڳتي تحقيق ڪئي ته ڇا هي عمل ER ايڪسپورٽ پروٽين ميڪانيزم جو ڪم پڻ شامل ڪري سگهي ٿو. GPI-AP ER ايڪسپورٽ لاءِ هڪ خاص COPII سسٽم استعمال ڪري ٿو، جيڪو GPI اينڪر جي گليڪان حصي جي Ted1 جي structural remodeling پاران فعال طور تي منظم ڪيو ويندو آهي (30، 31). پوءِ ٻيهر ڪمبيننٽ GPI-گليڪان کي ٽرانسميمبرين ڪارگو ريسيپٽر p24 ڪمپليڪس ذريعي سڃاتو ويندو آهي، جيڪو بدلي ۾ چونڊيل طور تي Lst1 کي ڀرتي ڪري ٿو، جيڪو وڏي COPII ڪارگو بائنڊنگ سب يونٽ Sec24 جو هڪ مخصوص آئسفارم آهي، هڪ GPI-AP سان ڀريل COPII ويسيڪل ٺاهيندو آهي (31-33). تنهن ڪري، اسان هڪ ڊبل ميوٽنٽ ٺاهيو جيڪو انهن واحد پروٽين (p24 ڪمپليڪس جزو Emp24، GPI-گليڪان ريموڊلنگ اينزائم Ted1 ۽ مخصوص COPII سب يونٽ Lst1) جي خارج ٿيڻ کي sec31-1 ميوٽنٽ اسٽرين سان گڏ ڪيو، ۽ انهن جو مطالعو ڪيو ته ڇا Gas1-ڪلسٽر GFP ٺاهڻ ممڪن آهي (شڪل 3). اسان ڏٺو ته sec31-1emp24Δ ۽ sec31-1ted1Δ ۾، Gas1-GFP بنيادي طور تي غير ڪلسٽر ٿيل آهي ۽ سڄي ER جھلي ۾ ورهايو ويو آهي، جيئن اڳ ۾ sec31-1 GhLag1 ۾ ڏٺو ويو هو، جڏهن ته sec31-1lst1Δ ۾، Gas1-GFP sec31-1 وانگر. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ER جھلي ۾ C26 سيرامائيڊ جي موجودگي کان علاوه، Gas1-GFP جي ڪلسٽرنگ کي پڻ p24 ڪمپليڪس سان ڳنڍڻ جي ضرورت آهي، ۽ ان کي مخصوص Lst1 ڀرتي جي ضرورت ناهي. پوءِ، اسان اهو امڪان ڳولي لڌو ته ER جھلي ۾ سيرامائيڊ جي زنجير جي ڊيگهه Gas1-GFP جي p24 سان پابند ٿيڻ کي منظم ڪري سگهي ٿي. بهرحال، اسان ڏٺو ته جھلي ۾ C18-C16 سيرامائيڊ جي موجودگي p24 ڪمپليڪس (شڪلون S3 ۽ S4، A ۽ B) پاران ٻيهر تعمير ڪيل GPI-گليڪينز يا GPI-AP سان پابند ٿيڻ ۽ GPI-AP برآمد ڪرڻ جي صلاحيت کي متاثر نه ڪندي آهي. COPII ذيلي قسم Lst1 (شڪل S4C) کي ڀرتي ڪريو. تنهن ڪري، C26 سيرامائيڊ تي منحصر ڪلسٽرنگ کي مختلف ER برآمد پروٽين ميڪانيزم سان پروٽين جي رابطي جي ضرورت ناهي، پر لپڊ جي ڊيگهه ذريعي هلائيندڙ متبادل ترتيب ڏيڻ واري ميڪانيزم کي سپورٽ ڪري ٿو. پوءِ، اسان تجزيو ڪيو ته ڇا ER جھلي ۾ سيرامائيڊ ايسيل چين جي ڊيگهه Gas1-GFP جي اثرائتي درجه بندي لاءِ چونڊيل ERES طور اهم آهي. جيئن ته GhLag1 اسٽرين ۾ Gas1 شارٽ چين سيرامائيڊ سان ER ڇڏي ٿو ۽ پلازما جھلي ۾ داخل ٿئي ٿو (شڪل S5)، اسان جو يقين آهي ته جيڪڏهن ترتيب ڏيڻ سيرامائيڊ ايسائل زنجير جي ڊيگهه سان هلائي وڃي ٿي، ته GhLag1 اسٽرين ۾ Gas1 کي ريڊائريڪٽ ۽ ڪراس ڪري سگهجي ٿو. ساڳئي جھلي سان ERES سامان.
(الف) GhLag1 جي سيل جھلي ۾ بنيادي طور تي ننڍا C18-C16 سيرامائڊ شامل آهن، جڏهن ته Gas1-GFP جي GPI اينڪر ۾ اڃا تائين جهنگلي قسم جي سيلز وانگر ساڳيو C26 IPC آهي. مٿي: ماس اسپيڪٽروميٽري (MS) ذريعي جهنگلي قسم (Wt) ۽ GhLag1p اسٽرين جي سيل جھلي ۾ سيرامائڊ جو ايسيل چين جي ڊيگهه جو تجزيو. ڊيٽا ڪل سيرامائڊ جي سيڪڙو جي نمائندگي ڪري ٿو. ٽن آزاد تجربن جو سراسري. غلطي بار = SD. ٻه دم وارو غير جوڙيل ٽي ٽيسٽ. **** P ＜0.0001. هيٺيون پينل: Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI اينڪر ۾ موجود IPC جي ايسيل چين جي ڊيگهه جو MS تجزيو جهنگلي قسم ۽ GhLag1p اسٽرين ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي. ڊيٽا ڪل IPC سگنل جي سيڪڙو جي نمائندگي ڪري ٿو. پنجن آزاد تجربن جو سراسري. غلطي بار = SD. ٻه دم وارو غير جوڙيل ٽي ٽيسٽ. ns، اهم ناهي. P = 0.9134. (ب) گليڪٽوز-حوصلہ افزائي گيس1-GFP کي ظاهر ڪندڙ sec31-1، sec31-1 GhLag1، sec31-1emp24Δ، sec31-1ted1Δ ۽ sec31-1lst1Δ سيلز جا فلوروسينس مائڪروگرافس 30 منٽن لاءِ 37°C تي انڪيوبيٽ ڪيا ويا ۽ 24°C کان پوءِ معمول جي فلوروسينس مائڪروسڪوپي کي انجام ڏيڻ لاءِ منتقل ڪيا ويا. اڇو تير: ER Gas1-GFP ڪلسٽر. کليل تير: غير ڪلسٽرڊ گيس1-GFP پوري ER جھلي تي ورهايو ويو آهي، ER خاصيت واري نيوڪليئر رنگ اسٽيننگ ڏيکاريندي. اسڪيل بار، 5μm. (ج) (ب) ۾ بيان ڪيل فوٽو مائڪروگراف جي مقدار. پنڪٽيٽ گيس1-GFP ڍانچي سان سيلز جو سراسري سيڪڙو. ٽن آزاد تجربن ۾، n≥300 سيلز. غلطي بار = SD. ٻه-ٽيل غير جوڙيل ٽي ٽيسٽ. **** پي ＜0.0001.
هن مسئلي کي سڌو سنئون حل ڪرڻ لاءِ، اسان GhLag1 ۾ sec31-1 گرمي پد جي حساس ميوٽنٽ ايليل (شڪل 4 ۽ مووي S4) سان GhLag1 ۾ Gas1-GFP ۽ Mid2-iRFP جو SCLIM ويزوئلائيزيشن ڪيو. ER کي 37°C تي برقرار رکڻ ۽ بعد ۾ 24°C تي جاري ڪرڻ کان پوءِ، نئين ٺهيل Gas1-GFP جو گهڻو حصو ڪلسٽر نه ڪيو ويو ۽ سڄي ER جھلي ۾ ورهايو ويو، جيئن روايتي خوردبيني (شڪل 4، A ۽ B) پاران مشاهدو ڪيو ويو آهي. ان کان علاوه، ERES (67%) جو هڪ وڏو سيڪڙو ان ۾ ٻه قسم جا ڪارگو گڏ ٿيل شامل آهن (شڪل 4D). شڪل 4C جا پينل 1 ۽ 2 ERES جا ٻه عام مثال ڏيکارين ٿا جن ۾ اوورليپنگ Gas1-GFP ۽ Mid2-GFP آهن. ان کان علاوه، ٻنهي سامان کي ساڳئي ERES ۾ ڀرتي ڪيو ويو (شڪل 4E، پينل 3 ۽ مووي S4). تنهن ڪري، اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ER جھلي ۾ سيرامائيڊ ايسائل چين جي ڊيگهه ER پروٽين جي مجموعي ۽ درجه بندي جو هڪ اهم تعين ڪندڙ آهي.
Sec31-1 GhLag1 سيل جيڪي گليڪٽوز-حوصلہ افزائي رطوبتن کي ظاهر ڪن ٿا، Gas1-GFP (GPI-AP، سائو) ۽ Mid2-iRFP (TMP، نيرو) ۽ آئيني ERES-ليبل ٿيل Sec13-mCherry (ERES، ميجنٽا) 37°C تي انڪيوبيٽ ڪن ٿا. 30 منٽن تائين جاري رکو، رطوبتن کي ڇڏڻ لاءِ 24°C تي ڇڏي ڏيو، ۽ 20 منٽن کان پوءِ SCLIM سان تصوير ڪڍو. (A کان C) ڪارگو ۽ ERES پاران نشان لڳل 10 z-سيڪشن جي نمائندگي ڪندڙ 2D پروجئشن تصويرون (A؛ اسڪيل بار، 1μm) يا 3D سيل هيمسفير تصويرون (B ۽ C؛ اسڪيل يونٽ، 0.45μm). (B) ۾ هيٺيون پينل ۽ (C) ۾ پينل صرف ERES (ميجنٽا) ۾ موجود سامان کي ڏيکارڻ لاءِ پروسيس ٿيل تصويرون ڏيکاري ٿو [Gas1-GFP (گرين) ۽ Mid2-iRFP (هلڪو نيرو)]. (C) اڇو ڀريل تير: ERES، سامان اوورليپ. کليل تير: ERES ۾ صرف هڪ شيءِ شامل آهي. هيٺيون پينل: چونڊيل ERES ۾ اوورليپنگ سامان (1 ۽ 2) آهن جيڪي (C) ۾ نشان لڳل آهن. اسڪيل بار، 100 nm. (D) (C) ۾ بيان ڪيل فوٽو مائڪروگراف جي مقدار. sec31-1 ۽ sec31-1 GhLag1 يونٽن ۾، صرف هڪ ڪارگو (Gas1-GFP يا Mid2-iRFP) شامل آهي، ۽ الڳ ٿيل ڪارگو ۽ اوورليپنگ ڪارگو لاءِ ERES جو سراسري سيڪڙو. ٽن آزاد تجربن ۾، 54 سيلز ۾ n = 432 (sec31-1) ۽ 47 سيلز ۾ n = 430 (sec31-1 GhLag1). غلطي بار = SD. ٻه-ٽيل غير جوڙيل ٽي ٽيسٽ. *** P = 0.0002 (sec31-1) ۽ ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) چونڊيل ERES جي 3D تصوير اوورليپنگ ڪارگو (3) سان (C) ۾ نشان لڳل آهي. گيس 1-GFP (سائي) ۽ مڊ 2-iRFP (نيرو) ساڳئي پاسي کان ERES (ميجنٽا) ڏانهن ايندا آهن ۽ ساڳئي ERES محدود علائقي ۾ رهندا آهن. اسڪيل بار، 100 nm.
هي مطالعو سڌو سنئون ثبوت فراهم ڪري ٿو ته لپڊ تي ٻڌل پروٽين ڪارگوز کي سيڪريٽري رستي ۾ چونڊيل برآمدي جڳهن ۾ درجه بندي ڪيو ويو آهي، ۽ درجه بندي جي چونڊ لاءِ ايسل چين جي ڊيگهه جي اهميت کي ظاهر ڪري ٿو. SCLIM نالي هڪ طاقتور ۽ جديد مائڪروسڪوپي ٽيڪنڪ استعمال ڪندي، اسان خمير ۾ نئين ٺهيل گيس 1-GFP (هڪ وڏي پلازما جھلي GPI-AP هڪ تمام ڊگهي ايسل چين (C26) سيرامائيڊ لپڊ حصو سان) جو مظاهرو ڪيو. ڊسڪريٽ ERs ۾ ڪلستر ٿيل علائقا مخصوص ERES سان لاڳاپيل آهن، جڏهن ته ٽرانسميمبرين سيڪريٽ پروٽين سڄي ER جھلي ۾ ورهايل آهن (شڪل 1). ان کان علاوه، اهي ٻه قسم جا سامان چونڊيل طور تي مختلف ERES ۾ داخل ٿين ٿا (شڪل 2). جھلي ۾ سيلولر سيرامائيڊ جي ايسل چين جي ڊيگهه C26 کان C18-C16 تائين گهٽجي ويندي آهي، گيس 1-GFP ڪلسٽر ڊسڪريٽ ER علائقي ۾ خراب ٿي ويندو آهي، ۽ گيس 1-GFP کي ساڳئي ERES ذريعي ٽرانسميمبرين پروٽين سان ER ڇڏڻ لاءِ ٻيهر روٽ ڪيو ويندو آهي (شڪل 3 ۽ شڪل 3). 4).
جيتوڻيڪ GPI-AP ER مان نڪرڻ لاءِ هڪ خاص پروٽين ميڪانيزم استعمال ڪري ٿو، اسان ڏٺو ته C26 سيرامائيڊ تي منحصر علحدگي مختلف پروٽين جي رابطي تي ڀروسو نٿو ڪري جيڪا ERES اسپيشلائيزيشن (شڪل S4 ۽ S5) جو سبب بڻجي سگهي ٿي. ان جي بدران، اسان جا نتيجا لپڊ تي ٻڌل پروٽين ڪلسٽرنگ ۽ بعد ۾ ٻين ڪارگوز جي خارج ٿيڻ جي ذريعي هلائي ويندڙ متبادل درجه بندي ميڪانيزم جي حمايت ڪن ٿا. اسان جا مشاهدا ظاهر ڪن ٿا ته هڪ مخصوص ERES سان لاڳاپيل Gas1-GFP علائقو يا ڪلسٽر ٽرانسميبرن سيڪريٽڊ پروٽين Mid2-iRFP جي کوٽ آهي، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته C26 سيرامائيڊ تي منحصر GPI-AP ڪلسٽر لاڳاپيل ERES ۾ انهن جي داخلا کي آسان بڻائيندو، ۽ ساڳئي وقت، ٽرانسميبرن کي خارج ڪري ٿو. رطوبت هن خاص ERES ۾ داخل ٿئي ٿي (شڪل 1 ۽ 2). ان جي ابتڙ، ER جھلي ۾ C18-C16 سيرامائيڊس جي موجودگي GPI-AP کي علائقن يا ڪلسٽر ٺاهڻ جو سبب نه بڻجندي آهي، تنهن ڪري اهي ٽرانسميبرن سيڪريٽڊ پروٽين کي ساڳئي ERES ۾ خارج يا تبديل نه ڪندا آهن (شڪل 3 ۽ 4). تنهن ڪري، اسان تجويز ڪريون ٿا ته C26 سيرامائيڊ مخصوص ERES سان ڳنڍيل پروٽين جي ڪلسٽرنگ کي آسان بڻائي الڳ ٿيڻ ۽ درجه بندي کي هلائي ٿو.
هڪ مخصوص ER علائقي ۾ هن C26 سيرامائيڊ تي منحصر ڪلسٽرنگ کي ڪيئن حاصل ڪجي؟ جھلي سيرامائيڊ جي پاسي کان الڳ ٿيڻ جو رجحان GPI-AP ۽ C26 سيرامائيڊ کي ER جھلي جي وڌيڪ غير منظم لپڊ ماحول ۾ ننڍا ۽ فوري طور تي ترتيب ڏنل لپڊ ٺاهڻ جو سبب بڻجي سگهي ٿو جنهن ۾ ننڍا ۽ غير سير ٿيل گليسرو لپڊس شامل آهن. معيار جا ڪلسٽر (17، 18). اهي ننڍا عارضي ڪلسٽر p24 ڪمپليڪس (34) سان ڳنڍڻ کان پوءِ وڌيڪ وڏن، وڌيڪ مستحڪم ڪلسٽرن ۾ ملائي سگهجن ٿا. ان سان مطابقت رکندڙ، اسان ڏيکاريو ته C26 Gas1-GFP کي وڏا نظر ايندڙ ڪلسٽر ٺاهڻ لاءِ p24 ڪمپليڪس سان لهه وچڙ ڪرڻ جي ضرورت آهي (شڪل 3). p24 ڪمپليڪس هڪ هيٽروزائگس اوليگومر آهي جيڪو خمير ۾ چار مختلف p24 ٽرانس ميمبرين پروٽين تي مشتمل آهي (35)، جيڪو ملٽي ويلنٽ بائنڊنگ فراهم ڪري ٿو، جيڪو ننڍڙن GPI-AP ڪلسٽرن جي ڪراس لنڪنگ جو سبب بڻجي سگهي ٿو، ان ڪري وڏو اسٽيبل ڪلسٽر (34) پيدا ڪري ٿو. GPI-APs جي پروٽين ايڪٽوڊومين جي وچ ۾ رابطي شايد انهن جي مجموعي ۾ حصو وٺي سگھي ٿي، جيئن انهن جي گولگي ٽرانسپورٽ دوران ممالين جي پولرائزڊ ايپيٿيليل سيلز ۾ ڏيکاريل آهي (36). جڏهن ته، جڏهن C18-C16 سيرامائيڊ ER جھلي ۾ موجود هوندو آهي، جڏهن p24 ڪمپليڪس Gas1-GFP سان ڳنڍيل هوندو آهي، ته وڏا الڳ ڪلسٽر نه ٺهندا. بنيادي ميڪانيزم ڊگهي ايسل چين سيرامائيڊ جي مخصوص جسماني ۽ ڪيميائي خاصيتن تي منحصر ٿي سگهي ٿو. مصنوعي جھلي جي بايو فزيڪل مطالعي مان ظاهر ٿئي ٿو ته جيتوڻيڪ ٻئي ڊگهي (C24) ۽ مختصر (C18-C16) ايسل چين سيرامائيڊ مرحلي جي علحدگي جو سبب بڻجي سگهن ٿا، صرف ڊگهي ايسل چين سيرامائيڊ (C24) فلم کي ٻيهر شڪل ڏيڻ لاءِ اعليٰ گھمڻ ۽ فلم موڙڻ کي فروغ ڏئي سگهن ٿا. باهمي حوالي سان (17، 37، 38). اهو ڏيکاريو ويو آهي ته TMED2 جو ٽرانسميمبرين هيلڪس، Emp24 جو انساني هم جنس، چونڊيل طور تي cytoplasmic lobules ۾ C18 سيرامائيڊ تي ٻڌل اسفنگومائيلين سان رابطو ڪري ٿو (39). ماليڪيولر ڊائنامڪس (MD) سموليشن استعمال ڪندي، اسان ڏٺو ته C18 ۽ C26 سيرامائيڊ ٻئي Emp24 ٽرانسميمبرين هيلڪس جي cytoplasmic lobules جي چوڌاري گڏ ٿين ٿا، ۽ انهن جون ساڳيون ترجيحون آهن (شڪل S6). اهو قابل ذڪر آهي ته اهو ظاهر ڪري ٿو ته Emp24 جو ٽرانسميمبرين هيلڪس جھلي ۾ لپڊس جي غير متناسب تقسيم جو سبب بڻجي سگهي ٿو. هي هڪ تازو نتيجو آهي جيڪو مماليا جي سيلن تي ٻڌل آهي. ساڳيا MD سموليشن پڻ ايٿر لپڊس جي موجودگي کي ظاهر ڪن ٿا (40). تنهن ڪري، اسان اندازو لڳايو ٿا ته ER26 جي ٻن لوبلز ۾ C26 سيرامائيڊ مقامي طور تي افزوده آهي. جڏهن لومينل لوبلز ۾ GPI-AP سڌو سنئون ملٽي ويلنٽ p24 سان ڳنڍيل هوندو آهي ۽ سائيٽوپلاسمڪ لوبلز ۾ p24 جي چوڌاري C26 سيرامائيڊ جو جمع ٿيندو آهي، ته اهو آڱرين ذريعي پروٽين جي مجموعي ۽ جھلي جي وکر کي پيدا ڪرڻ کي فروغ ڏئي سگهي ٿو (41)، جنهن جي ڪري GPI-AP ERES سان ملحق الڳ علائقن ۾ الڳ ٿي ويندو آهي، جيڪو ER جھلي جي انتهائي وکر وارن علائقن کي پڻ پسند ڪندو آهي (42). پوئين رپورٽون تجويز ڪيل ميڪانيزم جي حمايت ڪئي (43، 44). پلازما جھلي تي سيرامائيڊ تي ٻڌل گلائڪوسفنگوليپڊس (GSL) سان اوليگوليڪٽين، پيٿوجنز يا اينٽي باڊيز جو ملٽي ويلنٽ پابند وڏي GSL مجموعي کي متحرڪ ڪري ٿو، مرحلي جي علحدگي کي وڌائي ٿو ۽ جھلي جي خرابي ۽ اندروني ڪرڻ جو سبب بڻجي ٿو (44). ايوابوچي وغيره (43) اهو معلوم ٿيو ته ڊگهي (C24) پر ننڍي نه (C16) ايسل زنجيرن جي موجودگي ۾، GSL ليڪٽوسائل سيرامائيڊ سان ڳنڍيل ملٽي ويلنٽ ليگنڊ وڏن ڪلسٽرن ۽ جھلي جي انويجنيشن جي ٺهڻ کي متاثر ڪيو، ۽ ليفليٽس تي سائيٽوپلازم لين-ميڊيئيٽيڊ سگنل ٽرانسڊڪشن کي جوڙيل نيوٽروفيلز ۾ ايسل زنجيرن ذريعي انٽرڊجيٽيٽ ڪيو ويندو آهي.
ممالي جانورن جي پولرائزڊ ايپيٿيليل سيلز ۾، اينٽي گولگي نيٽ ورڪ (TGN) جو اپيڪل پلازما جھلي جي سطح تائين ڪنسنٽريشن GPI-AP جي علحدگي ۽ ترتيب کي ڪنٽرول ڪري ٿو (10، 45). هي مجموعو GPI-AP اوليگومرائيزيشن (36) ذريعي هلائي ٿو، پر اهو شايد سيرامائيڊ چين جي ڊيگهه تي پڻ منحصر هجي جيڪو اسان خمير ۾ ڳوليون ٿا. جيتوڻيڪ ممالي جانورن جي GPI-AP ۾ ايٿر لپڊ تي ٻڌل اينڪر آهي، ۽ ان جي ڪيميائي جوڙجڪ تمام ڊگهي ايسل چين سيرامائيڊ کان تمام مختلف آهي، هڪ تازي مطالعي مان معلوم ٿيو ته ٻنهي لپڊز ۾ ارتقائي طور تي ساڳي جسماني ۽ ڪيميائي خاصيتون ۽ ڪم (40) آهن. تنهن ڪري، ممالي جانورن جي سيلز ۾ ايٿر لپڊ حصو خمير ۾ C26 سيرامائيڊ سان ملندڙ جلندڙ ٿي سگهي ٿو، ۽ ان جو ڪردار GPI-AP مجموعي ۽ ترتيب کي فروغ ڏيڻ لاءِ جھلي ۾ ڊگهي زنجير سيرامائيڊ سان لاڳاپيل هجڻ آهي. جيتوڻيڪ هن امڪان کي اڃا تائين سڌو سنئون جانچڻ جي ضرورت آهي، پوئين دريافتون ان ڳالهه جي حمايت ڪن ٿيون ته گولگي جسم ۾ ڊگهي ايسل چين سيرامائيڊ جي ٽرانسپورٽ سائيٽوپلاسمڪ ٽرانسفر پروٽين ذريعي نه ڪئي ويندي آهي، پر خمير وانگر GPI اينڪرز جي سنٿيسس تي منحصر آهي. تنهن ڪري، ارتقائي قدامت پسند ميڪانيزم ساڳئي ٽرانسپورٽ ويسيڪل ۾ تمام ڊگهي ايسل چين سيرامائيڊ ۽ GPI-AP (13، 16، 20، 46، 47) کي چونڊيل طور تي گڏ منتقل ڪرڻ جي قابل نظر اچي ٿو.
خمير ۽ ممالي جي پولرائزڊ ايپيٿيليل سيل سسٽم ۾، GPI-AP جي مجموعي ۽ ٻين پلازما جھلي پروٽين کان الڳ ٿيڻ سڀ سيل جي مٿاڇري تائين پهچڻ کان اڳ ٿين ٿا. پالادينو ۽ ٻيا. (48) ڏٺائين ته ممالي جي پولرائزڊ ايپيٿيليل سيلز جي TGN تي، GPI-AP ڪلسٽرنگ نه رڳو اپيڪل پلازما جھلي تائين GPI-APs جي چونڊيل درجه بندي لاءِ ضروري آهي، پر GPI-APs جي ڪلسٽرنگ تنظيم ۽ ان جي حياتياتي سرگرمي کي پڻ منظم ڪري ٿو. سيل جي مٿاڇري. خمير ۾، هن مطالعي مان ظاهر ٿيو ته ER تي C26 سيرامائيڊ تي منحصر GPI-AP ڪلسٽر پلازما جھلي تي ڪلسٽر تنظيم ۽ GPI-AP جي فنڪشنل سرگرمي کي منظم ڪري سگهي ٿو (24، 49). هن ماڊل سان مطابقت رکندڙ، GhLag1 سيلز GPI انابيٽرز يا دوائن کان الرجڪ آهن جيڪي سيل وال سالميت کي متاثر ڪن ٿا (28)، ۽ خمير سيلز جي ميلاپ ۾ پيش ڪيل ٽِپ سيرامائيڊ جي فنڪشنل Gas1-GFP ڪلسٽرز (49) جي ضرورت G​​ کي ظاهر ڪري ٿي hLag1 سيلز جا ممڪن جسماني نتيجا. GPI-AP غلطي. جڏهن ته، وڌيڪ جانچ ڪرڻ ته ڇا سيل جي مٿاڇري جي فنڪشنل تنظيم کي لپڊ جي ڊيگهه جي بنياد تي ترتيب ڏيڻ واري طريقي سان ER کان پروگرام ڪيو ويو آهي، اسان جي مستقبل جي تحقيق جو موضوع هوندو.
هن ڪم ۾ استعمال ٿيندڙ Saccharomyces cerevisiae strains ٽيبل S1 ۾ درج ٿيل آهن. لائيو سيل اميجنگ لاءِ SCLIM جا MMY1583 ۽ MMY1635 strains W303 جي پس منظر ۾ ٺاهيا ويا هئا. اهي strains جيڪي Sec13-mCherry کي فلوروسينٽ پروٽين ٽيگ سان ظاهر ڪن ٿا، انهن کي پوليميرس چين ري ايڪشن (PCR) تي ٻڌل طريقو استعمال ڪندي pFA6a پلازميڊ سان ٽيمپليٽ (23) طور ٺاهيو ويو هو. GAL1 پروموٽر جي ڪنٽرول هيٺ فلوروسينٽ پروٽين سان ليبل ٿيل Mid2-iRFP کي ظاهر ڪندڙ strain هن ريت ٺاهيو ويو هو. pKTiRFP-KAN ویکٹر (E. O'Shea جو تحفو، ايڊجين پلازميڊ نمبر 64687؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ ريسرچ ريسورس سڃاڻپ ڪندڙ (RRID): Addgene_64687) مان iRFP-KanMx تسلسل جي PCR امپليفڪيشن ۽ اينڊوجين Mid2 جي C-ٽرمينس ۾ داخل ڪيو ويو. Mid2-iRFP جينوم تسلسل کي GAL1 پروموٽر ۾ وڌائڻ ۽ ڪلون ڪرڻ کان پوءِ، ان کي انٽيگريشن پلازمڊ pRS306 جي Not I-Sac I سائيٽ ۾ ضم ڪيو ويو. نتيجي ۾ پلازمڊ pRGS7 کي URA3 لوڪوس ۾ ضم ڪرڻ لاءِ Pst I سان لڪير ڪيو ويو.
گيس 1-GFP فيوزن جين سينٽروميئر (CEN) پلازمڊ ۾ GAL1 پروموٽر جي ڪنٽرول هيٺ ظاهر ڪيو ويندو آهي، جيڪو هن ريت ٺهيل آهي. گيس 1-GFP تسلسل کي PRS416-GAS1-GFP پلازمڊ (24) (L. Popolo جو تحفو) مان PCR ذريعي وڌايو ويو ۽ CEN پلازمڊ pBEVY-GL LEU2 (C جو تحفو) جي Xma I–Xho I سائيٽ ۾ ڪلون ڪيو ويو. ملر؛ ايڊجين پلازمڊ نمبر 51225؛ http://n2t.net/adddene: 51225؛ RRID: ايڊجين_51225). نتيجي ۾ پلازمڊ کي pRGS6 جو نالو ڏنو ويو. Axl2-GFP فيوزن جين کي پڻ pBEVY-GL LEU2 ویکٹر جي GAL1 پروموٽر جي ڪنٽرول هيٺ ظاهر ڪيو ويو آهي، ۽ ان جي تعمير هن ريت آهي. Axl2-GFP تسلسل کي PCR ذريعي pRS304-p2HSE-Axl2-GFP پلازمڊ (23) کان وڌايو ويو، ۽ pBEVY-GL LEU2 ویکٹر جي Bam HI-Pst I سائيٽ ۾ ڪلون ڪيو ويو. نتيجي ۾ پلازمڊ کي pRGS12 جو نالو ڏنو ويو. هن مطالعي ۾ استعمال ٿيندڙ اوليگونوڪليوليٽائڊس جو تسلسل ٽيبل S2 ۾ درج ٿيل آهي.
ان اسٽرين کي 0.2٪ ايڊينائن ۽ 2٪ گلوڪوز [YP-dextrose (YPD)]، 2٪ رافينوز [YP-raffinose] سان مالا مال خمير ڪڍڻ واري پروٽين p (YP) وچولي (1٪ خمير ڪڍڻ ۽ 2٪ پروٽين ept). (YPR)] يا 2٪ گليڪٽوز [YP-galactose (YPG)] سان ڪاربن ذريعو طور تي، يا هڪ مصنوعي گهٽ ۾ گهٽ وچولي (0.15٪ خمير نائٽروجن بيس ۽ 0.5٪ امونيم سلفيٽ) ۾ غذائيت لاءِ گهربل مناسب امينو ايسڊ ۽ بيسز کي پورو ڪرڻ لاءِ، ۽ 2٪ گلوڪوز (مصنوعي گلوڪوز گهٽ ۾ گهٽ وچولي) يا 2٪ گليڪٽوز (مصنوعي گليڪٽوز گهٽ ۾ گهٽ وچولي) تي مشتمل ڪاربن ذريعو طور تي شامل ڪيو ويو.
ريئل ٽائيم تصويرن لاءِ، GAL1 پروموٽر جي تحت تعمير جو اظهار ڪندڙ گرمي پد-حساس sec31-1 ميوٽنٽ سيلز کي YPR ميڊيم ۾ رات جو 24°C تي وچ لاگ مرحلي ۾ وڌو ويو. YPG ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ 24°C تي شامل ڪرڻ کان پوءِ، سيلز کي SG ۾ 30 منٽن لاءِ 37°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ سيڪريشن بلاڪ مان ڇڏڻ لاءِ 24°C تي منتقل ڪيو ويو. ڪنڪاناولين A کي شيشي جي سلائڊ تي سيلز کي درست ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو ۽ SCLIM پاران تصوير ڪئي وئي. SCLIM اولمپس IX-71 انورٽيڊ فلوروسينس مائڪروسڪوپ ۽ UPlanSApo 100×1.4 عددي ايپرچر آئل لينس (اولمپس)، تيز رفتار ۽ تيز سگنل کان شور جي تناسب سان گھمڻ واري ڊسڪ ڪنفوڪل اسڪينر (يوڪوگاوا اليڪٽرڪ)، ڪسٽم اسپيڪٽروميٽر، ۽ ڪسٽم کولنگ جو ميلاپ آهي. سسٽم جو تصوير انٽينسيفائر (هماماتسو فوٽونڪس) هڪ ميگنيفائنگ لينس سسٽم مهيا ڪري سگهي ٿو جنهن ۾ ×266.7 جي آخري ميگنيفڪيشن ۽ هڪ چارج-ڪپلڊ ڊيوائس ڪئميرا آهي جيڪو اليڪٽرانن کي ضرب ڏئي ٿو (هماماتسو فوٽونڪس) (21). تصوير حاصل ڪرڻ ڪسٽم سافٽ ويئر (يوڪوگاوا اليڪٽرڪ) ذريعي ڪيو ويندو آهي. 3D تصويرن لاءِ، اسان هڪ ڪسٽم ٺهيل پيزو اليڪٽرڪ ايڪٽيوٽر استعمال ڪيو ته جيئن مقصدي لينس کي عمودي طور تي وائبريٽ ڪيو وڃي، ۽ آپٽيڪل حصن کي 100 nm جي فاصلي تي اسٽيڪ ۾ گڏ ڪيو وڃي. Z-اسٽيڪ تصوير کي 3D ووڪسل ڊيٽا ۾ تبديل ڪيو ويندو آهي، ۽ گھمڻ واري ڊسڪ ڪنفوڪل مائڪروسڪوپ لاءِ استعمال ٿيندڙ نظرياتي پوائنٽ اسپريڊ فنڪشن وولسٽي سافٽ ويئر (پرڪن ايلمر) پاران ڊيڪونولوشن پروسيسنگ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. گڏيل جڳھ جي تجزيي لاءِ خودڪار حد مقرر ڪرڻ لاءِ وولوسٽي سافٽ ويئر استعمال ڪندي، ڪارگو سميت ERES جي ماپ ڪئي وئي. لائن اسڪين تجزيو ميٽا مورف سافٽ ويئر (ماليڪيولر ڊيوائسز) استعمال ڪندي ڪيو ويو.
شمارياتي اهميت کي طئي ڪرڻ لاءِ گراف پيڊ پرزم سافٽ ويئر استعمال ڪريو. ٻن-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ ۽ عام هڪ طرفي تجزيي جي ويرينس (ANOVA) ٽيسٽ لاءِ، گروپن جي وچ ۾ فرق کي P <0.05 (*) تي اهم اثر سمجهيو ويندو آهي.
Gas1-GFP جي فلوروسينس مائڪروسڪوپي لاءِ، لاگ فيز سيلز کي YPD ۾ رات جو اُڀاريو ويو ۽ سينٽرفيوگيشن ذريعي گڏ ڪيو ويو، فاسفيٽ بفر ٿيل لوڻ سان ٻه ڀيرا ڌوئي ويو، ۽ گهٽ ۾ گهٽ 15 منٽن لاءِ برف تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ خوردبيني هيٺ اڳتي وڌو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي چيڪ (24). حاصل ڪرڻ لاءِ ليڪا DMi8 خوردبيني (HCX PL APO 1003/1.40 تيل PH3 CS) هڪ آبجيڪٽو لينس، L5 (GFP) فلٽر، هاماماتسو ڪئميرا ۽ ايپليڪيشن سوٽ X (LAS X) سافٽ ويئر سان ليس هو. .
نمونن کي 10 منٽن لاءِ 65°C تي SDS نموني بفر سان ڊينيچر ڪيو ويو، ۽ پوءِ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) ذريعي الڳ ڪيو ويو. اميونوبلوٽنگ تجزيي لاءِ، هر لين ۾ 10 μl نموني لوڊ ڪيو ويو. پرائمري اينٽي باڊي: خرگوش پولي ڪلونل اينٽي گيس 1 کي 1:3000 جي ڊائليشن تي، خرگوش پولي ڪلونل اينٽي ايم پي 24 کي 1:500 جي ڊائليشن تي، ۽ خرگوش پولي ڪلونل اينٽي GFP (H. Riezman کان تحفو) کي 1:3000 جي ڊائليشن تي استعمال ڪريو. ماؤس مونوڪلونل اينٽي Pgk1 اينٽي باڊي کي 1:5000 جي ڊائليشن تي استعمال ڪيو ويو (جي. ڊي لا ڪروز کان تحفو). ثانوي اينٽي باڊي: هارسريڊش پيرو آڪسائيڊس (HRP) ڪنجوگيٽڊ بکري اينٽي خرگوش اميونوگلوبلين G (IgG) کي 1:3000 (پيئرس) جي ڊائليشن تي استعمال ڪيو ويو. HRP-ڪنجوگيٽڊ ٻڪري اينٽي ماؤس IgG کي 1:3000 (پيئرس) جي ڊائليشن تي استعمال ڪيو ويو. مدافعتي ردعمل زون کي سپر سگنل ويسٽ پيڪو ري ايجنٽ (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) جي ڪيميلومينسنس طريقي سان ڏٺو ويو.
جيئن (31) ۾ بيان ڪيو ويو آهي، هڪ قدرتي مدافعتي تجربو افزوده ER حصي تي ڪيو ويو. مختصر ۾، خمير جي سيلن کي TNE بفر [50 mM tris-HCl (pH 7.5)، 150 mM NaCl، 5 mM EDTA، 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ۽ protease inhibitor mixture) سان 600 nm (OD600) تي 100 آپٽيڪل کثافت تي ٻه ڀيرا ڌوئڻ. ان کي شيشي جي موتين سان ٽوڙيو ويو، ۽ پوءِ سيل ملبہ ۽ شيشي جي موتين کي سينٽرفيوگيشن ذريعي هٽايو ويو. پوءِ سپرنيٽينٽ کي 17,000 گرام تي 15 منٽن لاءِ 4°C تي سينٽرفيوگ ڪيو ويو. پيلٽ کي TNE ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو ۽ ڊجيٽلس سيپونين کي 1% جي آخري ڪنسنٽريشن ۾ شامل ڪيو ويو. معطلي کي 4°C تي گردش سان 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ غير حل ٿيندڙ اجزاء کي 13,000 گرام تي 4°C تي 60 منٽن لاءِ سينٽرفيوگيشن ذريعي هٽايو ويو. Gas1-GFP اميونوپريسيپٽيشن لاءِ، پهريان نموني کي خالي ايگروز بيڊز (ChromoTek) سان 4°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ اڳ ۾ انڪيوبيٽ ڪريو، ۽ پوءِ GFP-Trap_A (ChromoTek) سان 4°C تي 3 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو. اميونوپريسيپٽيٽڊ بيڊز کي 0.2% ڊيگوڪسيجنن تي مشتمل TNE سان پنج ڀيرا ڌوتو ويو، SDS نموني بفر سان ايلوٽ ڪيو ويو، SDS-PAGE تي الڳ ڪيو ويو، ۽ اميونوبلوٽنگ ذريعي تجزيو ڪيو ويو.
جيئن (31) ۾ بيان ڪيو ويو آهي، افزوده ER فريڪشن تي ڪراس لنڪنگ ڊيٽرمنيشن ڪئي وئي. مختصر طور تي، افزوده ER فريڪشن کي 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (پيئرس، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، راڪفورڊ، IL، USA؛ 20°C، 20 منٽ) سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ڪراس لنڪنگ ري ايڪشن کي گلائسين (50 mM فائنل ڪنسنٽريشن، 5 منٽ، 20°C) شامل ڪندي ختم ڪيو ويو.
جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي (50)، جهنگلي قسم ۽ GhLag1 اسٽرين ۾ سيرامائيڊ جو MS تجزيو ڪيو ويو. مختصر ۾، سيلز کي YPD ۾ 30°C تي ايڪسپونينشل فيز (3 کان 4 OD600 يونٽ/ml) تائين وڌايو ويو، ۽ 25×107 سيلز کي ڪٽيو ويو. انهن جي ميٽابولزم کي ٽرائڪلورواسيٽڪ ايسڊ سان ختم ڪيو ويندو آهي. ايڪسٽرڪشن سالوينٽ [ايٿانول، پاڻي، ايٿر، پائريڊائن ۽ 4.2 N امونيم هائيڊرو آڪسائيڊ (15:15:5:1:0.018 v/v)] ۽ اندروني معياري C17 سيرامائيڊ (860517، اوانٽي پولر لپڊ) معيار جو 1.2 nmol استعمال ڪريو. مونوميٿيلامائن ري ايجنٽ [ميٿانول، پاڻي، اين-بيوٽانول ۽ ميٿيلامائن محلول (4:3:1:5 v/v)] استعمال ڪريو اقتباس جي هلڪي الڪائن هائيڊولائيزيشن ڪرڻ لاءِ، ۽ پوءِ ڊيسالٽ ڪرڻ لاءِ پاڻي سان ڀريل اين-بيوٽانول استعمال ڪريو. آخرڪار، ڪڍڻ کي مثبت موڊ سالوينٽ [ڪلوروفارم/ميٿانول/پاڻي (2:7:1) + 5 ايم ايم امونيم ايسٽيٽ] ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو ۽ ماس اسپيڪٽروميٽر ۾ داخل ڪيو ويو. اسفنگوليپڊ ماليڪيولز جي سڃاڻپ ۽ مقدار جي لاءِ ملٽي ري ايڪشن مانيٽرنگ (ايم آر ايم) ڪئي وئي. ٽي ايس ڪيو وينٽيج ٽيٽيري ڪواڊروپول ماس اسپيڪٽروميٽر (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) لپڊ تجزيو لاءِ روبوٽڪ نانو فلو آئن سورس نانو ميٽ ايڇ ڊي (ايڊوئن بايو سائنسز، اٿاڪا، نيو يارڪ) سان ليس آهي. ٽڪراءُ جي توانائي هر سيرامائيڊ ڪيٽيگري لاءِ بهتر ڪئي وئي آهي. ايم ايس ڊيٽا مثبت موڊ ۾ حاصل ڪيو ويو. هر حياتياتي نقل لاءِ، لپڊ سگنل ٽن آزاد ماپن جو وچين آهي.
جيئن (31) ۾ بيان ڪيو ويو آهي، گيس 1-GFP کي ظاهر ڪندڙ سيلز (800×107) قدرتي مدافعتي نظام جي تابع هئا. صاف ٿيل گيس 1-GFP کي SDS-PAGE ذريعي الڳ ڪيو ويو ۽ هڪ پولي ونائلائيڊين فلورائيڊ (PVDF) جھلي ڏانهن منتقل ڪيو ويو. پروٽين کي PVDF کي امائيڊ بليڪ سان داغ ڏيڻ سان تصور ڪيو ويو. گيس 1-GFP بينڊ کي PVDF مان ڪٽيو ويو ۽ ميٿانول سان 5 ڀيرا ۽ هڪ ڀيرو مائع ڪروميٽوگرافي-MS (LC-MS) گريڊ پاڻي سان ڌوئيو ويو. جھلي جي پٽي کي 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)، بفر ۽ 500μl تازو حل ٿيل 1 M سوڊيم نائٽرائٽ مرکب سان 37°C تي 3 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪرڻ سان، لپڊ فريڪشن گيس 1-GFP مان آزاد ڪيو ويندو آهي ۽ گلوڪوزامين ۽ انوسٽول (51) جي وچ ۾ انوسين فاسفيٽ سيرامائيڊ جي lysed ڇڏڻ. ان کان پوءِ، جھلي جي پٽي کي LC-MS گريڊ پاڻي سان چار ڀيرا ڌوئي، ڪمري جي حرارت تي خشڪ ڪيو ويو، ۽ تجزيو تائين -80 ° C تي نائٽروجن ماحول ۾ محفوظ ڪيو ويو. ڪنٽرول جي طور تي، هر تجربي لاءِ PVDF جھلي جو هڪ خالي نمونو استعمال ڪيو ويو. Gas1-GFP مان ڪڍيل لپڊ کي پوءِ MS پاران تجزيو ڪيو ويو جيئن بيان ڪيو ويو آهي (50). مختصر ۾، GPI-lipid تي مشتمل PVDF پٽين کي 75μl منفي مولڊ سالوينٽ [ڪلوروفارم/ميٿانول (1:2) + 5 mM امونيم ايسٽيٽ] ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو ۽ اسفنگوليپڊ اسپيسيز (TSQ وينٽيج) جي اليڪٽرو اسپري آئنائيزيشن (ESI)-MRM/MS تجزيو پاس ڪيو ويو. هن صورت ۾، MS ڊيٽا منفي آئن موڊ ۾ حاصل ڪيو ويو.
جيئن اڳ ذڪر ڪيو ويو آهي، GPI اينڪر جو لپڊ حصو [3H]-inositol-ليبل ٿيل GPI-AP (16) کان الڳ ڪيو ويو. لپڊس کي ٿلهي پرت جي ڪروميٽوگرافي ذريعي سالوينٽ سسٽم (55:45:10 ڪلوروفارم-ميٿانول-0.25٪ KCl) استعمال ڪندي الڳ ڪيو ويو ۽ FLA-7000 (Fujifilm) استعمال ڪندي تصور ڪيو ويو.
Gas1-GFP (600×107) ظاهر ڪندڙ سيلز کي TNE بفر سان ٻه ڀيرا ڌوتو ويو، ۽ شيشي جي موتين سان ٽوڙيو ويو، ۽ پوءِ سيل جي ملبي ۽ شيشي جي موتين کي هٽائڻ لاءِ سينٽريفيوگ ڪيو ويو. پوءِ سپرنيٽينٽ کي 17,000 گرام تي 4°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ سينٽريفيوگ ڪيو ويو. پيلٽ کي TNE ۾ ڌوتو ويو ۽ TNE ۾ 1 U PI-PLC (Invitrogen) سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو جنهن ۾ 0.2% ڊجيٽلس سيپونين 37°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ هو. اينزائم جي علاج کان پوءِ، جھلي کي سينٽريفيوگيشن ذريعي 17,000 گرام تي 4°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ هٽايو ويو. Gas1-GFP کي مدافعتي بڻائڻ لاءِ، سپرنيٽينٽ کي رات جو 4°C تي GFP-Trap_A (ChromoTek) سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. SDS-PAGE پاران الڳ ڪيل صاف ٿيل Gas1-GFP کي Coomassie brilliant blue سان رنگيو ويو. گيس 1-GFP اسٽيننگ بينڊ کي پاڻي جي چوڌاري گرين رنگ کان ڪٽيو ويو، ۽ پوءِ آئوڊو ايسيٽامائيڊ سان الڪائليشن ۽ ڊيٿيوٿريٽول سان گهٽتائي کان پوءِ، ٽرپسن سان ان-جيل هضم ڪيو ويو. ٽرپٽڪ پيپٽائڊس ۽ پيپٽائڊس کي GPI-گليڪين سان ڪڍو ۽ خشڪ ڪريو. خشڪ پيپٽائڊ کي 20 μl پاڻي ۾ حل ڪيو ويو. هڪ حصو (8μl) LC ۾ داخل ڪريو. هڪ آڪٽاڊيسيلسيلين (ODS) ڪالم (ڊيويلوسل 300ODS-HG-5؛ اندروني قطر 150 ملي ميٽر × 1.0 ملي ميٽر؛ نومورا ڪيميڪل، ايچي پريفيڪچر، جاپان) مخصوص گريڊينٽ حالتن هيٺ پيپٽائڊس کي الڳ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. موبائل مرحلو سالوينٽ A (0.08٪ فارمڪ ايسڊ) ۽ سالوينٽ B (80٪ ايسٽونائيٽريل ۾ 0.15٪ فارمڪ ايسڊ) آهي. هڪ Accela HPLC سسٽم (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، بوسٽن، ميساچوسٽس) استعمال ڪيو ويو ڪالم کي سالوينٽ A سان 55 منٽن اندر 50 μl منٽ-1 جي وهڪري جي شرح تي 5 منٽن لاءِ ايليوٽ ڪرڻ لاءِ، ۽ پوءِ سالوينٽ B جي ڪنسنٽريشن کي 40٪ تائين وڌايو ويو.، آمريڪا). ايليوٽ کي مسلسل ESI آئن سورس ۾ متعارف ڪرايو ويو، ۽ ٽرپٽڪ پيپٽائڊس ۽ GPI-گليڪين سان پيپٽائڊس جو تجزيو LTQ Orbitrap XL (هائبرڊ لينئر آئن ٽريپ-اوربيٽراپ ماس اسپيڪٽروميٽر؛ ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) پاران ڪيو ويو. MS سيٽ اپ ۾، ڪيپيلري سورس جو وولٽيج 4.5 kV تي مقرر ڪيو ويو، ۽ ٽرانسفر ڪيپيلري جو گرمي پد 300 ° C تي رکيو ويو. ڪيپيلري وولٽيج ۽ ٽيوب لينس وولٽيج ترتيب وار 15 V ۽ 50 V تي مقرر ڪيا ويا. ايم ايس ڊيٽا مثبت آئن موڊ ۾ حاصل ڪيو ويو (60,000 جي ريزوليوشن؛ 10 حصن في ملين جي ماس درستگي) 300/m/z ماس/چارج تناسب (m/z) 3000 جي ماس رينج ۾. ايم ايس/ايم ايس ڊيٽا LTQ Orbitrap XL ۾ آئن ٽريپ ذريعي حاصل ڪيو ويو آهي [پهرين 3 انگ جن تي ڊيٽا منحصر آهي، ٽڪراءَ جي ڪري پيدا ٿيندڙ ڊسوسيئيشن (CID)].
MD سموليشن GROMACS (52) سافٽ ويئر ۽ MARTINI 2 فورس فيلڊ (53-55) استعمال ڪندي ڪيا ويا. پوءِ CHARMM GUI ميمبرين بلڊر (56، 57) کي ڊائيوليولفاسفٽيڊيلڪولين (DOPC) ۽ Cer C18 يا DOPC ۽ Cer C26 تي مشتمل هڪ بائليئر ٺاهڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. Cer C26 جي ٽوپولوجي ۽ ڪوآرڊينيٽس DXCE مان اسفنگوسين ٽيل مان اضافي موتي هٽائي حاصل ڪيا ويا آهن. ڊبل پرت کي متوازن ڪرڻ ۽ ان کي هلائڻ لاءِ هيٺ بيان ڪيل عمل کي استعمال ڪريو، پوءِ Emp24 تي مشتمل سسٽم ٺاهڻ لاءِ سسٽم جي آخري ڪوآرڊينيٽس استعمال ڪريو. خمير Emp24 (باقي 173 کان 193) جو ٽرانس ميمبرين ڊومين بصري MD (VMD) ٽول ماليڪيولر structure (58) استعمال ڪندي α-helix جي طور تي ٺاهيو ويو. پوءِ، اوورليپنگ لپڊس کي هٽائڻ کان پوءِ، پروٽين کي ٿلهي طور تي گرينول ڪيو ويو ۽ CHARMM GUI استعمال ڪندي بائليئر ۾ داخل ڪيو ويو. آخري نظام ۾ 1202 DOPC ۽ 302 Cer C26 يا 1197 DOPC ۽ 295 Cer C18 ۽ Emp24 شامل آهن. سسٽم کي 0.150M جي ڪنسنٽريشن تائين آئنائيز ڪريو. ٻن بائي ليئر ڪمپوزيشن لاءِ چار آزاد نقل ٺاهيا ويا.
لپڊ بائليئر کي CHARMM GUI عمل استعمال ڪندي متوازن ڪيو ويندو آهي، جنهن ۾ 405,000 قدمن کي گھٽ ڪرڻ ۽ پوءِ متوازن ڪرڻ شامل آهي، جتي پوزيشن جي پابنديون بتدريج گھٽجي وينديون آهن ۽ ختم ڪيون وينديون آهن، ۽ وقت جو قدم 0.005 ps کان 0.02 ps تائين وڌايو ويندو آهي. توازن کان پوءِ، اهو 0.02 ps جي وقت جي قدم سان 6 µs پيدا ڪري ٿو. Emp24 داخل ڪرڻ کان پوءِ، سسٽم کي گھٽ ڪرڻ ۽ متوازن ڪرڻ لاءِ ساڳيو CHARMM GUI عمل استعمال ڪريو، ۽ پوءِ پيداوار ۾ 8 سيڪنڊن لاءِ هلايو.
سڀني سسٽمن لاءِ، بيلنسنگ جي عمل دوران، دٻاءُ کي بيرينڊسن باروسٽٽ (59) ذريعي ڪنٽرول ڪيو ويندو آهي، ۽ پيداوار جي عمل دوران، دٻاءُ کي پيرينيلو-رحمان باروسٽٽ (60) ذريعي ڪنٽرول ڪيو ويندو آهي. سڀني حالتن ۾، سراسري دٻاءُ 1 بار آهي ۽ هڪ نيم-آئسوٽروپڪ پريشر ڪپلنگ اسڪيم استعمال ڪئي ويندي آهي. بيلنس ۽ پيداوار جي عمل ۾، تيز رفتار ريڪيليبريشن سان هڪ ٿرموسٽٽ (61) استعمال ڪيو ويندو آهي پروٽين، لپڊ ۽ سالوينٽ ذرڙن جي گرمي پد کي ترتيب ڏيڻ لاءِ. پوري آپريشن دوران، ٽارگيٽ گرمي پد 310K آهي. نان بانڊنگ انٽراڪشن جو حساب 0.005 بفر رواداري سان ورليٽ اسڪيم استعمال ڪندي هڪ پيئرنگ لسٽ ٺاهي ڪري ڪيو ويندو آهي. ڪولمب اصطلاح کي رد عمل جي ميدان ۽ 1.1 nm جي ڪٽ آف فاصلي کي استعمال ڪندي حساب ڪيو ويندو آهي. وينڊر والز اصطلاح 1.1 nm جي ڪٽ آف فاصلي سان ڪٽ آف اسڪيم استعمال ڪندو آهي، ۽ ورليٽ ڪٽ آف اسڪيم امڪاني ڊرفٽ (62) لاءِ استعمال ڪئي ويندي آهي.
VMD استعمال ڪندي، DOPC فاسفيٽ موتي يا سيرامائيڊ AM1 موتي ۽ پروٽين جي وچ ۾ ڪٽ آف طول موج 0.7 nm آهي، ۽ پروٽين سان لهه وچڙ ڪندڙ لپڊز جو تعداد ڳڻيو ويندو آهي. هيٺ ڏنل فارمولي جي مطابق، گهٽتائي-افزودگي (DE) عنصر جو حساب ڪريو جيئن (63): DE عنصر = (پروٽين 0.7 ۾ ڪل لپڊز جو مقدار) پروٽين 0.7 ۾ (ڪل لپڊز ۾ Cer جو مقدار)
رپورٽ ٿيل قدر سراسري طور حاصل ڪئي وئي آهي، ۽ غلطي بار SE جون چار آزاد ڪاپيون آهن. DE عنصر جي شمارياتي اهميت t ٽيسٽ [(averageDE-factor-1)/SE] ذريعي ڳڻپيو ويندو آهي. هڪ-ٽيل ورڇ مان P قدر جو حساب ڪريو.
GROMACS ٽول کي ٽريس جي آخري 250 ns اندر Emp24 تي مشتمل سسٽم جي 2D ليٽرل ڊينسٽي ميپ کي ڳڻڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. سيرامائيڊ جي افزودگي/گهٽتائي ميپ حاصل ڪرڻ لاءِ، Cer جي ڊينسٽي ميپ کي Cer ۽ DOPC جي ميپ جي مجموعي سان ورهايو ويندو آهي، ۽ پوءِ جسم ۾ Cer جي ڪنسنٽريشن سان ورهايو ويندو آهي. ساڳيو رنگ نقشو اسڪيل استعمال ڪيو ويندو آهي.
هن مضمون لاءِ اضافي مواد لاءِ، مهرباني ڪري ڏسو http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
هي هڪ کليل رسائي وارو مضمون آهي جيڪو ڪريٽو ڪامنز انتساب-غير-ڪمرشل لائسنس جي شرطن تحت ورهايو ويو آهي، جيڪو ڪنهن به وچولي ۾ استعمال، ورڇ ۽ ٻيهر پيداوار جي اجازت ڏئي ٿو، جيستائين آخري استعمال تجارتي فائدي لاءِ نه هجي ۽ بنياد اهو هجي ته اصل ڪم صحيح آهي. حوالو.
نوٽ: اسان توهان کي صرف پنهنجو اي ميل پتو ڏيڻ لاءِ چئون ٿا ته جيئن توهان جنهن شخص کي صفحي تي سفارش ڪري رهيا آهيو اهو ڄاڻي ته توهان چاهيو ٿا ته اهي اي ميل ڏسن ۽ اهو اسپام نه آهي. اسان ڪو به اي ميل پتو نه پڪڙينداسين.
هي سوال جانچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته ڇا توهان هڪ مهمان آهيو ۽ خودڪار اسپام جمع ڪرائڻ کي روڪڻ لاءِ.
صوفيا روڊريگيز-گالارڊو، ڪازو ڪروکاوا، سوزانا سبيدو-بوزو، اليجندرو ڪورٽيز · گومز (اليجندرو ڪورٽيز-گومز)، اتسوڪو ايڪدا (آتسوڪو ايڪيدا)، والريا زوني (والريا زوني)، آڪسيلياڊورا اگويليرا-روميرو، اينا لوجيو سيروگيو (انا لوزيو) لوپيز)، ميهو واگا (ميهو واگا)، ميساکو ارمان (مياکو آرمان)، مياکو ريمان (مياکو ريمان)، پرو آکيرا، اسٽيفانو فاني، اکهيکو ناکانو، مينوئل منز
3D هاءِ ريزوليوشن ريئل ٽائيم اميجنگ چونڊيل آئوٽ پُٽ سائيٽن ۾ پروٽين جي ترتيب لاءِ سيرامائيڊ چين جي ڊيگهه جي اهميت کي ظاهر ڪري ٿي.
صوفيا روڊريگيز-گالارڊو، ڪازو ڪروکاوا، سوزانا سبيدو-بوزو، اليجندرو ڪورٽيز · گومز (اليجندرو ڪورٽيز-گومز)، اتسوڪو ايڪدا (آتسوڪو ايڪيدا)، والريا زوني (والريا زوني)، آڪسيلياڊورا اگويليرا-روميرو، اينا لوجيو سيروگيو (انا لوزيو) لوپيز)، ميهو واگا (ميهو واگا)، ميساکو ارمان (مياکو آرمان)، مياکو ريمان (مياکو ريمان)، پرو آکيرا، اسٽيفانو فاني، اکهيکو ناکانو، مينوئل منز
3D هاءِ ريزوليوشن ريئل ٽائيم اميجنگ چونڊيل آئوٽ پُٽ سائيٽن ۾ پروٽين جي ترتيب لاءِ سيرامائيڊ چين جي ڊيگهه جي اهميت کي ظاهر ڪري ٿي.
©2020 سائنس جي ترقي لاء آمريڪي ايسوسيئيشن. سڀ حق محفوظ آهن. AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef ۽ COUNTER جو شريڪ آھي. سائنس ايڊوانسز ISSN 2375-2548.