اسان اڳ ۾ رپورٽ ڪئي هئي ته جگر جي فائبروسس جي مريضن ۾ گٽ مان نڪتل ٽرپٽوفن ميٽابولائٽ انڊول-3-پروپيونڪ ايسڊ (IPA) جي سيرم ليول گهٽ هوندي آهي. هن مطالعي ۾، اسان سيرم IPA ليول جي حوالي سان موهيندڙ جگر ۾ ٽرانسڪرپٽوم ۽ ڊي اين اي ميٿيلوم جي جاچ ڪئي، انهي سان گڏ ويٽرو ۾ هيپاٽڪ اسٽيليٽ سيلز (HSCs) جي فينوٽائپڪ غير فعال ٿيڻ ۾ IPA جي ڪردار جي جاچ ڪئي.
مطالعي ۾ 116 ٿلها مريض شامل هئا جن کي ٽائپ 2 ذیابيطس ميليٽس (T2DM) کان سواءِ (عمر 46.8 ± 9.3 سال؛ BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) ڪوپيو بيرياٽرڪ سرجري سينٽر (KOBS) ۾ بيرياٽرڪ سرجري ڪرائي وئي. گردش ڪندڙ IPA ليولز کي مائع ڪروميٽوگرافي-ماس اسپيڪٽروميٽري (LC-MS) ذريعي ماپيو ويو، جگر جي ٽرانسڪرپٽوم تجزيو ڪل RNA سيڪوئنسنگ ذريعي ڪيو ويو، ۽ DNA ميٿيليشن تجزيو انفينيم هيومن ميٿيليشن 450 بيڊ چپ استعمال ڪندي ڪيو ويو. انساني هيپاٽڪ اسٽيليٽ سيلز (LX-2) کي ان ويٽرو تجربن لاءِ استعمال ڪيو ويو.
سيرم IPA جي سطح جگر ۾ اپوپٽوٽڪ، مائيٽوفاجڪ، ۽ ڊگهي عمر جي رستن ۾ شامل جين جي اظهار سان لاڳاپيل هئي. AKT سيرين/ٿرونائن ڪائنس 1 (AKT1) جين جگر جي ٽرانسڪرپٽ ۽ ڊي اين اي ميٿيليشن پروفائلز ۾ سڀ کان وڌيڪ گهڻائي ۽ غالب رابطي واري جين هئي. IPA علاج اپوپٽوسس کي متاثر ڪيو، مائيٽوڪونڊريل تنفس ۾ گهٽتائي ڪئي، ۽ LX-2 سيلز جي فائبروسس، اپوپٽوسس، ۽ بقا کي منظم ڪرڻ لاءِ سڃاتل جين جي اظهار کي ماڊل ڪندي سيل مورفولوجي ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس کي تبديل ڪيو.
گڏ ڪيل، اهي ڊيٽا ان ڳالهه جي حمايت ڪن ٿا ته IPA ۾ امڪاني علاج جا اثر آهن ۽ اهو اپوپٽوسس کي متاثر ڪري سگهي ٿو ۽ HSC فينوٽائپ کي هڪ غير فعال حالت ڏانهن منتقل ڪري سگهي ٿو، انهي ڪري HSC ايڪٽيويشن ۽ مائيٽوڪونڊريل ميٽابولزم ۾ مداخلت ڪندي جگر جي فائبروسس کي روڪڻ جي امڪان کي وڌائي ٿو.
موٽاپي ۽ ميٽابولڪ سنڊروم جي پکڙجڻ کي ميٽابولڪ طور تي لاڳاپيل فيٽي ليور ڊزيز (MASLD) جي وڌندڙ واقعن سان لاڳاپيل ڪيو ويو آهي؛ هي بيماري عام آبادي جي 25٪ کان 30٪ کي متاثر ڪري ٿي [1]. MASLD ايٽولوجي جو مکيه نتيجو جگر فائبروسس آهي، هڪ متحرڪ عمل جيڪو فائبروسس ايڪسٽرا سيلولر ميٽرڪس (ECM) جي مسلسل جمع ٿيڻ سان منسوب ڪيو ويو آهي [2]. جگر فائبروسس ۾ شامل مکيه سيلز هيپاٽڪ اسٽيلٽ سيلز (HSCs) آهن، جيڪي چار سڃاتل فينوٽائپس ڏيکارين ٿا: خاموش، چالو، غير فعال، ۽ سنسنٽ [3، 4]. HSCs کي چالو ڪري سگهجي ٿو ۽ هڪ خاموش شڪل کان وڌندڙ فائبروبلاسٽ جهڙي سيلز ۾ منتقل ڪري سگهجي ٿو جنهن ۾ اعلي توانائي جي گهرج آهي، α-هموار عضلاتي ايڪٽين (α-SMA) ۽ قسم I ڪوليجن (Col-I) [5، 6] جي وڌندڙ اظهار سان. جگر فائبروسس ريورسل دوران، چالو HSCs کي اپوپٽوسس يا غير فعال ٿيڻ ذريعي ختم ڪيو ويندو آهي. انهن عملن ۾ فائبروجينڪ جينز جي گهٽتائي ۽ پروسروائيول جينز جي ماڊليشن (جهڙوڪ NF-κB ۽ PI3K/Akt سگنلنگ رستا) [7، 8]، انهي سان گڏ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۽ ڪم ۾ تبديليون شامل آهن [9].
آنڊن ۾ پيدا ٿيندڙ ٽرپٽوفن ميٽابولائٽ انڊول-3-پروپيونڪ ايسڊ (IPA) جي سيرم ليول، انساني ميٽابولڪ بيمارين ۾ گهٽجي وئي آهي، جنهن ۾ MASLD [10-13] شامل آهن. IPA غذائي فائبر جي استعمال سان لاڳاپيل آهي، ان جي اينٽي آڪسيڊنٽ ۽ سوزش مخالف اثرات لاءِ مشهور آهي، ۽ غذا جي ڪري پيدا ٿيندڙ غير الڪوحل اسٽيو هيپاٽائٽس (NASH) فينوٽائپ کي گهٽائي ٿو ان ويوو ۽ ان ويٽرو [11-14]. ڪجهه ثبوت اسان جي پوئين مطالعي مان مليا آهن، جنهن اهو ظاهر ڪيو ته ڪوپيو بيرياٽرڪ سرجري اسٽڊي (KOBS) ۾ جگر جي فائبروسس کان سواءِ موهي مريضن جي ڀيٽ ۾ جگر جي فائبروسس جي مريضن ۾ سيرم IPA ليول گهٽ هئا. ان کان علاوه، اسان ڏيکاريو ته IPA علاج جينز جي اظهار کي گهٽائي سگهي ٿو جيڪي انساني هيپاٽڪ اسٽيليٽ سيل (LX-2) ماڊل ۾ سيل آسنجن، سيل لڏپلاڻ ۽ هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيل ايڪٽيويشن جا ڪلاسيڪل مارڪر آهن ۽ هڪ امڪاني هيپاٽوپروٽيڪٽو ميٽابولائٽ آهي [15]. بهرحال، اهو واضح ناهي ته IPA HSC اپوپٽوسس ۽ مائيٽوڪونڊريل بايو اينرجيٽڪس کي چالو ڪندي جگر جي فائبروسس ريگريشن کي ڪيئن متاثر ڪري ٿو.
هتي، اسان اهو ظاهر ڪريون ٿا ته سيرم IPA ٿلهي پر غير قسم 2 ذیابيطس (KOBS) فردن جي جگر ۾ اپوپٽوسس، مائيٽوفيگي، ۽ ڊگهي عمر جي رستن ۾ افزوده جين جي اظهار سان لاڳاپيل آهي. وڌيڪ، اسان ڏٺو ته IPA غير فعال ٿيڻ واري رستي ذريعي چالو ٿيل هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيلز (HSCs) جي صفائي ۽ خرابي کي متاثر ڪري سگهي ٿو. اهي نتيجا IPA لاءِ هڪ ناول ڪردار ظاهر ڪن ٿا، ان کي جگر فائبروسس ريگريشن کي فروغ ڏيڻ لاءِ هڪ امڪاني علاج جو هدف بڻائي ٿو.
KOBS ڪوهورٽ ۾ هڪ پوئين مطالعي مان ظاهر ٿيو ته جگر جي فائبروسس جي مريضن ۾ جگر جي فائبروسس کان سواءِ مريضن جي مقابلي ۾ گهٽ گردش ڪندڙ IPA ليول هئا [15]. ٽائپ 2 ذیابيطس جي امڪاني مونجهاري واري اثر کي خارج ڪرڻ لاءِ، اسان 116 موهيندڙ مريضن کي ٽائيپ 2 ذیابيطس کان سواءِ (اوسط عمر ± SD: 46.8 ± 9.3 سال؛ BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (ٽيبل 1) کي جاري KOBS مطالعي مان مطالعي جي آبادي [16] جي طور تي شامل ڪيو. سڀني شرڪت ڪندڙن تحريري طور تي باخبر رضامندي ڏني ۽ مطالعي جي پروٽوڪول کي هيلسنڪي جي اعلان (54/2005، 104/2008 ۽ 27/2010) جي مطابق نارتھ ساوو ڪائونٽي اسپتال جي اخلاقي ڪميٽي پاران منظور ڪيو ويو.
جگر جي بايوپسي جا نمونا بيريٽرڪ سرجري دوران حاصل ڪيا ويا ۽ تجربيڪار پيٿولوجسٽن پاران اڳ ۾ بيان ڪيل معيار [17، 18] جي مطابق هسٽولوجيڪل طور تي جائزو ورتو ويو. تشخيص جا معيار ضمني جدول S1 ۾ اختصار ڪيا ويا آهن ۽ اڳ ۾ بيان ڪيا ويا آهن [19].
فاسٽنگ سيرم جي نمونن جو تجزيو غير نشانو بڻايل مائع ڪروميٽوگرافي-ماس اسپيڪٽروميٽري (LC-MS) ذريعي ميٽابولومڪس تجزيو لاءِ ڪيو ويو (n = 116). نمونن جو تجزيو UHPLC-qTOF-MS سسٽم (1290 LC، 6540 qTOF-MS، Agilent Technologies، Waldbronn، Karlsruhe، Germany) استعمال ڪندي ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي19. آئسوپروپيل الڪوحل (IPA) جي سڃاڻپ برقرار رکڻ جي وقت ۽ MS/MS اسپيڪٽرم جي خالص معيارن سان مقابلي تي ٻڌل هئي. سڀني وڌيڪ تجزين ۾ IPA سگنل جي شدت (چوٽي واري علائقي) تي غور ڪيو ويو [20].
پوري جگر جي آر اين اي جي ترتيب Illumina HiSeq 2500 استعمال ڪندي ڪئي وئي ۽ ڊيٽا کي اڳ ۾ بيان ڪيل طور تي اڳ ۾ پروسيس ڪيو ويو [19، 21، 22]. اسان MitoMiner 4.0 ڊيٽابيس مان چونڊيل 1957 جينز استعمال ڪندي مائيٽوڪونڊريل فنڪشن / بايوجينيسس کي متاثر ڪندڙ ٽرانسڪرپٽس جو ٽارگيٽڊ ڊفرنشل ايڪسپريشن تجزيو ڪيو [23]. جگر جي ڊي اين اي ميٿيليشن تجزيو انفينيئم هيومن ميٿيليشن 450 بيڊ چپ (ايلومينا، سين ڊياگو، سي اي، آمريڪا) استعمال ڪندي ساڳيو طريقو استعمال ڪندي ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [24، 25].
انساني هيپاٽڪ اسٽيلٽ سيلز (LX-2) مهرباني ڪري پروفيسر اسٽيفانو روميو پاران مهيا ڪيا ويا ۽ انهن کي DMEM/F12 ميڊيم (بايو ويسٽ، L0093-500، 1٪ پين/اسٽريپ؛ لونزا، DE17-602E، 2٪ FBS؛ گبڪو، 10270-106) ۾ ڪلچر ڪيو ويو ۽ برقرار رکيو ويو. IPA جي ڪم ڪندڙ دوز کي چونڊڻ لاءِ، LX-2 سيلز کي DMEM/F12 ميڊيم ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ IPA جي مختلف ڪنسنٽريشن (10 μM، 100 μM ۽ 1 mM؛ سگما، 220027) سان علاج ڪيو ويو. ان کان علاوه، HSCs کي غير فعال ڪرڻ لاءِ IPA جي صلاحيت جي جاچ ڪرڻ لاءِ، LX-2 سيلز کي 5 ng/ml TGF-β1 (R&D سسٽم، 240-B-002/CF) ۽ 1 mM IPA سان 24 ڪلاڪن لاءِ سيرم فري ميڊيم ۾ گڏيل علاج ڪيو ويو. لاڳاپيل گاڏين جي ڪنٽرولن لاءِ، TGF-β1 علاج لاءِ 0.1% BSA تي مشتمل 4 nM HCL استعمال ڪيو ويو ۽ IPA علاج لاءِ 0.05% DMSO استعمال ڪيو ويو، ۽ ٻنهي کي گڏيل علاج لاءِ گڏ استعمال ڪيو ويو.
ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق 7-AAD (بايوليگينڊ، سين ڊياگو، CA، USA، Cat# 640922) سان FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit استعمال ڪندي اپوپٽوسس جو جائزو ورتو ويو. مختصر طور تي، LX-2 (1 × 105 سيلز/ويل) کي رات جو 12-ويل پليٽن ۾ ڪلچر ڪيو ويو ۽ پوءِ IPA يا IPA ۽ TGF-β1 جي ڪيترن ئي دوائن سان علاج ڪيو ويو. ايندڙ ڏينهن، فلوٽنگ ۽ ايڊرينٽ سيلز کي گڏ ڪيو ويو، ٽرپسينائيز ڪيو ويو، PBS سان ڌوئي ويو، Annexin V بائنڊنگ بفر ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو، ۽ FITC-Annexin V ۽ 7-AAD سان 15 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو.
Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) استعمال ڪندي جاندار سيلز ۾ Mitochondria کي آڪسائيڊيوٽو سرگرمي لاءِ داغ ڏنو ويو. MTR اسيس لاءِ، LX-2 سيلز کي IPA ۽ TGF-β1 سان برابر کثافت تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. 24 ڪلاڪن کان پوءِ، جاندار سيلز کي ٽرپسينائيز ڪيو ويو، PBS سان ڌوتو ويو، ۽ پوءِ 100 μM MTR سان سيرم فري ميڊيم ۾ 37 °C تي 20 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [26]. جاندار سيل مورفولوجي تجزيي لاءِ، سيل سائيز ۽ سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي جو تجزيو ترتيب وار فارورڊ اسڪيٽر (FSC) ۽ سائڊ اسڪيٽر (SSC) پيرا ميٽرز استعمال ڪندي ڪيو ويو.
سڀ ڊيٽا (30,000 واقعا) نوو سائٽ ڪوانٽيون (ايجيلينٽ) استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا ۽ نوو ايڪسپريس® 1.4.1 يا فلوجو وي.10 سافٽ ويئر استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو.
آڪسيجن جي استعمال جي شرح (OCR) ۽ ايڪسٽرا سيلولر ايسڊفڪيشن ريٽ (ECAR) کي حقيقي وقت ۾ سيهورس ايڪسٽرا سيلولر فلڪس اينالائيزر (ايجيلينٽ ٽيڪنالاجيز، سانتا ڪلارا، CA) استعمال ڪندي ماپيو ويو جيڪو ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق سيهورس ايڪس ايف سيل ميٽو اسٽريس سان ليس هو. مختصر طور تي، 2 × 104 LX-2 سيلز/ويل کي XF96 سيل ڪلچر پليٽس تي سيڊ ڪيو ويو. رات جو انڪيوبيشن کان پوءِ، سيلز کي آئسوپروپنول (IPA) ۽ TGF-β1 (سپليمينٽري طريقا 1) سان علاج ڪيو ويو. ڊيٽا تجزيو سيهورس ايڪس ايف ويو سافٽ ويئر استعمال ڪندي ڪيو ويو، جنهن ۾ سيهورس ايڪس ايف سيل انرجي فينوٽائپ ٽيسٽ رپورٽ جنريٽر شامل آهي. ان مان، هڪ بايو اينرجٽڪ هيلٿ انڊيڪس (BHI) جو حساب ڪيو ويو [27].
ڪُل آر اين اي کي سي ڊي اين اي ۾ نقل ڪيو ويو. مخصوص طريقن لاءِ، حوالو ڏسو [15]. انساني 60S رائبوسومل ايسڊڪ پروٽين P0 (RPLP0) ۽ سائڪلوفيلين A1 (PPIA) mRNA ليولز کي جزوي جين ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. ڪوانٽ اسٽوڊيو 6 پرو ريئل ٽائيم پي سي آر سسٽم (ٿرمو فشر، لينڊسميئر، دي نيدرلينڊز) کي ٽاڪ مين ™ فاسٽ ايڊوانسڊ ماسٽر مڪس ڪٽ (اپلائيڊ بايو سسٽم) يا سينسفاسٽ SYBR لو-ROX ڪٽ (بايولين، BIO 94050) سان استعمال ڪيو ويو، ۽ نسبتي جين ايڪسپريشن فولڊ کي تقابلي Ct ويليو سائيڪلنگ پيرا ميٽرز (ΔΔCt) ۽ ∆∆Ct طريقو استعمال ڪندي ڳڻيو ويو. پرائمرز جي تفصيل ضمني جدولن S2 ۽ S3 ۾ مهيا ڪئي وئي آهي.
نيوڪليئر ڊي اين اي (اين سي ڊي اين اي) ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊي اين اي (ايم ٽي ڊي اين اي) کي ڊي اين ايزي بلڊ اينڊ ٽشو ڪِٽ (ڪياجن) استعمال ڪندي ڪڍيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [28]. ايم ٽي ڊي اين اي جي نسبتي مقدار جو حساب هر ٽارگيٽ ايم ٽي ڊي اين اي علائقي جي ٽن نيوڪليئر ڊي اين اي علائقن (ايم ٽي ڊي اين اي/اين سي ڊي اين اي) جي جاميٽري اوسط سان تناسب جي حساب سان ڪيو ويو، جيئن ضمني طريقا 2 ۾ تفصيل سان بيان ڪيو ويو آهي. ايم ٽي ڊي اين اي ۽ اين سي ڊي اين اي لاءِ پرائمر جي تفصيل ضمني جدول S4 ۾ مهيا ڪئي وئي آهي.
زنده سيلز کي Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) سان رنگ ڏنو ويو ته جيئن انٽرسيلولر ۽ انٽراسيلولر مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ کي ڏسڻ لاءِ. LX-2 سيلز (1 × 104 سيلز/ويل) کي شيشي جي سلائڊن تي لاڳاپيل شيشي جي هيٺان ڪلچر پليٽس (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) ۾ ڪلچر ڪيو ويو. 24 ڪلاڪن کان پوءِ، زنده LX-2 سيلز کي 100 μM MTR سان 20 منٽن لاءِ 37 °C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو ۽ سيل نيوڪلئي کي DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) سان رنگ ڏنو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [29]. Mitochondrial نيٽ ورڪن کي Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) استعمال ڪندي تصور ڪيو ويو جيڪو Zeiss LSM 800 confocal module سان ليس آهي 37 °C تي هڪ نمي واري ماحول ۾ 5% CO2 سان 63×NA 1.3 مقصد استعمال ڪندي. اسان هر نموني جي قسم لاءِ ڏهه Z-سيريز تصويرون حاصل ڪيون. هر Z-سيريز ۾ 30 حصا آهن، هر هڪ جي ٿولهه 9.86 μm آهي. هر نموني لاءِ، ZEN 2009 سافٽ ويئر (ڪارل زيس مائڪرو اميجنگ GmbH، جينا، جرمني) استعمال ڪندي ڏهه مختلف فيلڊ آف وييو جون تصويرون حاصل ڪيون ويون، ۽ mitochondrial مورفولوجي تجزيو ImageJ سافٽ ويئر (v1.54d) [30، 31] استعمال ڪندي ضمني طريقا 3 ۾ تفصيلي پيرا ميٽرز جي مطابق ڪيو ويو.
سيلز کي 0.1 ايم فاسفيٽ بفر ۾ 2٪ گلوٽاراالڊيهائيڊ سان درست ڪيو ويو، ان کان پوءِ 1٪ اوسميم ٽيٽرو آڪسائيڊ محلول (سگما الڊرچ، ايم او، آمريڪا) سان درست ڪيو ويو، بتدريج ايسٽون سان ڊيهائيڊريٽ ڪيو ويو (مرڪ، ڊارمسٽڊٽ، جرمني)، ۽ آخرڪار ايپوڪسي رال ۾ شامل ڪيو ويو. الٽرا ٿن سيڪشن تيار ڪيا ويا ۽ 1٪ يورينيل ايسٽيٽ (مرڪ، ڊارمسٽڊٽ، جرمني) ۽ 1٪ ليڊ سائٽريٽ (مرڪ، ڊارمسٽڊٽ، جرمني) سان رنگ ڪيو ويو. الٽرا اسٽرڪچرل تصويرون 80 ڪلو وي جي تيز رفتار وولٽيج تي JEM 2100F EXII ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپ (JEOL لميٽيڊ، ٽوڪيو، جاپان) استعمال ڪندي حاصل ڪيون ويون.
24 ڪلاڪن تائين IPA سان علاج ڪيل LX-2 سيلز جي مورفولوجي جو تجزيو فيز-ڪنٽراسٽ مائڪروسڪوپي ذريعي 50x ميگنيفڪيشن تي Zeiss انورٽڊ لائيٽ مائڪروسڪوپ (Zeiss Axio Vert.A1 ۽ AxioCam MRm، جينا، جرمني) استعمال ڪندي ڪيو ويو.
ڪلينڪل ڊيٽا کي سراسري ± معياري انحراف يا وچين (انٽرڪوارٽائل رينج: IQR) طور ظاهر ڪيو ويو. ٽنهي مطالعي جي گروپن جي وچ ۾ فرقن جو مقابلو ڪرڻ لاءِ ويرينس (مسلسل متغير) يا χ² ٽيسٽ (ڪلاسيڪل متغير) جو هڪ طرفو تجزيو استعمال ڪيو ويو. غلط مثبت شرح (FDR) کي گھڻن ٽيسٽنگ لاءِ درست ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، ۽ FDR < 0.05 سان جين کي شمارياتي طور تي اهم سمجهيو ويو. اسپيئرمين رابطي جو تجزيو IPA سگنل جي شدت سان CpG DNA ميٿيليشن کي ڳنڍڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، جنهن ۾ نامياري p قدر (p < 0.05) رپورٽ ڪيا ويا.
رستي جو تجزيو ويب تي ٻڌل جين سيٽ تجزيي ٽول (ويب گيسٽالٽ) استعمال ڪندي 268 ٽرانسڪرپٽس (نامياري پي < 0.01)، 119 مائيٽوڪونڊريا سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽس (نامياري پي < 0.05)، ۽ 3093 جگر جي ٽرانسڪرپٽس مان 4350 سي پي جيز لاءِ ڪيو ويو جيڪي گردش ڪندڙ سيرم IPA ليولز سان لاڳاپيل هئا. آزاد طور تي دستياب ويني ڊي بي (ورژن 2.1.0) ٽول اوورليپنگ جينز ڳولڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، ۽ اسٽرنگ ڊي بي (ورزن 11.5) پروٽين-پروٽين جي رابطي کي ڏسڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو.
LX-2 تجربي لاءِ، نمونن کي ڊي اگوسٽينو-پيئرسن ٽيسٽ استعمال ڪندي نارملٽي لاءِ جانچيو ويو. ڊيٽا گهٽ ۾ گهٽ ٽن حياتياتي نقلن مان حاصل ڪئي وئي ۽ بونفروني پوسٽ هاڪ ٽيسٽ سان هڪ طرفي ANOVA جي تابع ڪئي وئي. 0.05 کان گهٽ جي p-قدر کي شمارياتي طور تي اهم سمجهيو ويو. ڊيٽا کي اوسط ± SD طور پيش ڪيو ويو آهي، ۽ هر شڪل ۾ تجربن جو تعداد ظاهر ڪيو ويو آهي. سڀئي تجزيا ۽ گراف ونڊوز لاءِ گراف پيڊ پرزم 8 شمارياتي سافٽ ويئر استعمال ڪندي ڪيا ويا (گراف پيڊ سافٽ ويئر انڪارپوريٽڊ، ورجن 8.4.3، سين ڊياگو، آمريڪا).
پهرين، اسان سيرم IPA ليولز جي جگر، سڄي جسم، ۽ مائيٽوڪونڊريل ٽرانسڪرپٽس سان وابستگي جي جاچ ڪئي. ڪل ٽرانسڪرپٽ پروفائل ۾، سيرم IPA ليولز سان لاڳاپيل سڀ کان مضبوط جين MAPKAPK3 هو (FDR = 0.0077؛ مائيٽوجن-فعال پروٽين ڪائنيز-فعال پروٽين ڪائنيز 3)؛ مائيٽوڪونڊريل سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽ پروفائل ۾، سڀ کان مضبوط لاڳاپيل جين AKT1 هو (FDR = 0.7621؛ AKT سيرين/ٿريونائن ڪائنيز 1) (اضافي فائل 1 ۽ اضافي فائل 2).
پوءِ اسان عالمي ٽرانسڪرپٽس (n = 268؛ p < 0.01) ۽ مائيٽوڪونڊريا سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽس (n = 119؛ p < 0.05) جو تجزيو ڪيو، آخرڪار اپوپٽوسس کي سڀ کان اهم ڪيننيڪل رستي (p = 0.0089) جي طور تي سڃاڻيو. سيرم IPA جي سطحن سان لاڳاپيل مائيٽوڪونڊريا ٽرانسڪرپٽس لاءِ، اسان اپوپٽوسس (FDR = 0.00001)، مائيٽوفيگي (FDR = 0.00029)، ۽ TNF سگنلنگ رستن (FDR = 0.000006) تي ڌيان ڏنو (شڪل 1A، ٽيبل 2، ۽ ضمني شڪلون 1A-B).
انساني جگر ۾ گلوبل، مائيٽوڪونڊريا سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽس، ۽ ڊي اين اي ميٿيليشن جو اوورليپنگ تجزيو سيرم IPA ليولز سان لاڳاپيل آهي. A 268 گلوبل ٽرانسڪرپٽس، 119 مائيٽوڪونڊريا سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽس، ۽ ڊي اين اي ميٿيلائيڊ ٽرانسڪرپٽس جي نمائندگي ڪري ٿو جيڪي سيرم IPA ليولز سان لاڳاپيل 3092 CpG سائيٽن تي ميپ ٿيل آهن (p ويليوز < 0.01 گلوبل ٽرانسڪرپٽس ۽ ڊي اين اي ميٿيلائيڊ لاءِ، ۽ p ويليوز < 0.05 مائيٽوڪونڊريا ٽرانسڪرپٽس لاءِ). مکيه اوورليپنگ ٽرانسڪرپٽس وچ ۾ ڏيکاريا ويا آهن (AKT1 ۽ YKT6). B ٻين جينز سان سڀ کان وڌيڪ انٽراڪشن اسڪور (0.900) سان 13 جينز جو انٽراڪشن ميپ 56 اوورليپنگ جينز (ڪارو لڪير وارو علائقو) مان ٺاهيو ويو جيڪي آن لائن ٽول StringDB استعمال ڪندي سيرم IPA ليولز سان خاص طور تي لاڳاپيل هئا. سائو: جينز جين اونٽولوجي (GO) سيلولر جزو سان ميپ ٿيل آهن: مائيٽوڪونڊريا (GO:0005739). AKT1 اهو پروٽين آهي جنهن کي ڊيٽا جي بنياد تي ٻين پروٽينن سان رابطي لاءِ سڀ کان وڌيڪ اسڪور (0.900) حاصل ٿيو آهي (ٽيڪسٽ مائننگ، تجربن، ڊيٽابيس، ۽ ڪو-اظهار جي بنياد تي). نيٽ ورڪ نوڊس پروٽين جي نمائندگي ڪن ٿا، ۽ ڪنارا پروٽين جي وچ ۾ رابطن جي نمائندگي ڪن ٿا.
جيئن ته گٽ مائڪرو بائيوٽا ميٽابولائٽس ڊي اين اي ميٿيليشن [32] ذريعي ايپي جينيٽڪ ساخت کي منظم ڪري سگهن ٿا، اسان تحقيق ڪئي ته ڇا سيرم IPA ليول جگر جي ڊي اين اي ميٿيليشن سان لاڳاپيل هئا. اسان ڏٺو ته سيرم IPA ليول سان لاڳاپيل ٻه وڏيون ميٿيليشن سائيٽون پرولين-سيرين سان مالا مال خطو 3 (C19orf55) ۽ گرمي جھٽڪو پروٽين فيملي B (ننڍو) ميمبر 6 (HSPB6) (اضافي فائل 3) جي ويجهو هيون. 4350 CpG (p < 0.01) جو ڊي اين اي ميٿيليشن سيرم IPA ليول سان لاڳاپيل هو ۽ ڊگهي عمر جي ريگيوليٽري رستن (p = 0.006) (شڪل 1A، ٽيبل 2، ۽ ضمني شڪل 1C) ۾ افزوده ڪيو ويو.
انساني جگر ۾ سيرم IPA ليولز، گلوبل ٽرانسڪرپٽس، مائيٽوڪونڊريا سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽس، ۽ ڊي اين اي ميٿيليشن جي وچ ۾ تعلق کي سمجهڻ لاءِ، اسان پوئين رستي جي تجزيي (شڪل 1A) ۾ سڃاڻپ ڪيل جينز جو اوورليپ تجزيو ڪيو. 56 اوورليپنگ جينز (شڪل 1A ۾ ڪاري لڪير جي اندر) جي رستي جي افزودگي جي تجزيي جا نتيجا ڏيکاريا ته اپوپٽوسس رستو (p = 0.00029) ٽن تجزين ۾ عام ٻن جينز کي نمايان ڪيو: AKT1 ۽ YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog)، جيئن وين ڊاگرام ۾ ڏيکاريل آهي (ضمني شڪل 2 ۽ شڪل 1A). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اسان ڏٺو ته AKT1 (cg19831386) ۽ YKT6 (cg24161647) مثبت طور تي سيرم IPA ليولز سان لاڳاپيل هئا (اضافي فائل 3). جين شين جي وچ ۾ امڪاني پروٽين جي رابطي جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ، اسان 56 اوورليپنگ جينز مان ان پٽ جي طور تي سڀ کان وڌيڪ عام علائقي جي اسڪور (0.900) سان 13 جينز کي چونڊيو ۽ هڪ رابطي جو نقشو ٺاهيو. اعتماد جي سطح (حاشيي اعتماد) جي مطابق، سڀ کان وڌيڪ اسڪور (0.900) سان AKT1 جين مٿي هو (شڪل 1B).
رستي جي تجزيي جي بنياد تي، اسان ڏٺو ته اپوپٽوسس اهم رستو هو، تنهن ڪري اسان تحقيق ڪئي ته ڇا IPA علاج HSCs جي اپوپٽوسس کي متاثر ڪندو ان ويٽرو ۾. اسان اڳ ۾ اهو ظاهر ڪيو ته IPA جا مختلف دوز (10 μM، 100 μM، ۽ 1 mM) LX-2 سيلز لاءِ غير زهر هئا [15]. هن مطالعي مان ظاهر ٿيو ته 10 μM ۽ 100 μM تي IPA علاج قابل عمل ۽ نيڪروٽڪ سيلز جو تعداد وڌايو. جڏهن ته، ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾، سيل جي قابل عمل 1 mM IPA ڪنسنٽريشن تي گهٽجي ويو، جڏهن ته سيل نڪروسس جي شرح تبديل نه ٿي رهي (شڪل 2A، B). اڳيون، LX-2 سيلز ۾ اپوپٽوسس کي وڌائڻ لاءِ بهترين ڪنسنٽريشن ڳولڻ لاءِ، اسان 24 ڪلاڪن لاءِ 10 μM، 100 μM، ۽ 1 mM IPA جي جانچ ڪئي (شڪل 2A-E ۽ ضمني شڪل 3A-B). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، IPA 10 μM ۽ 100 μM اپوپٽوسس جي شرح (٪) کي گهٽائي ڇڏيو، جڏهن ته، IPA 1 mM ڪنٽرول جي مقابلي ۾ دير سان اپوپٽوسس ۽ اپوپٽوسس جي شرح (٪) کي وڌايو ۽ تنهن ڪري وڌيڪ تجربن لاءِ چونڊيو ويو (شڪل 2A-D).
IPA LX-2 سيلز جي اپوپٽوسس کي متاثر ڪري ٿو. اينيڪسين V ۽ 7-AAD ڊبل اسٽيننگ جو طريقو استعمال ڪيو ويو ته جيئن فلو سائٽوميٽري ذريعي اپوپٽوٽڪ ريٽ ۽ سيل مورفولوجي کي مقدار ۾ رکيو وڃي. BA سيلز کي 24 ڪلاڪن لاءِ 10 μM، 100 μM ۽ 1 mM IPA سان يا F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ۽ 1 mM IPA سان سيرم فري ميڊيم ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. A: زنده سيلز (اينيڪسين V -/ 7AAD-)؛ B: نيڪروٽڪ سيلز (اينيڪسين V -/ 7AAD+)؛ C، F: شروعاتي (اينيڪسين V +/ 7AAD-)؛ D، G: دير سان (اينيڪسين V+/7AAD.+)؛ E، H: اپوپٽوٽڪ ريٽ ۾ ڪل شروعاتي ۽ دير سان اپوپٽوٽڪ سيلز جو سيڪڙو (%). ڊيٽا کي سراسري ± SD، n = 3 آزاد تجربن جي طور تي ظاهر ڪيو ويو آهي. شمارياتي مقابلو بونفروني پوسٽ هاڪ ٽيسٽ سان هڪ طرفي ANOVA استعمال ڪندي ڪيو ويو. *p < 0.05؛ ****p < 0.0001
جيئن اسان اڳ ۾ ڏيکاريو آهي، 5 ng/ml TGF-β1 ڪلاسيڪل مارڪر جينز جي اظهار کي وڌائي HSC ايڪٽيويشن کي متاثر ڪري سگهي ٿو [15]. LX-2 سيلز کي 5 ng/ml TGF-β1 ۽ 1 mM IPA سان ميلاپ ۾ علاج ڪيو ويو (شڪل 2E–H). TGF-β1 علاج اپوپٽوسس جي شرح کي تبديل نه ڪيو، جڏهن ته، IPA جي گڏيل علاج TGF-β1 علاج (شڪل 2E–H) جي مقابلي ۾ دير سان اپوپٽوسس ۽ اپوپٽوسس جي شرح (%) کي وڌايو. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته 1 mM IPA TGF-β1 انڊڪشن کان آزاد طور تي LX-2 سيلز ۾ اپوپٽوسس کي فروغ ڏئي سگهي ٿو.
اسان LX-2 سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل تنفس تي IPA جي اثر جي وڌيڪ جاچ ڪئي. نتيجن مان ظاهر ٿيو ته 1 mM IPA آڪسيجن جي استعمال جي شرح (OCR) پيرا ميٽرز کي گهٽائي ڇڏيو: غير مائيٽوڪونڊريل تنفس، بيسل ۽ وڌ ۾ وڌ تنفس، پروٽون ليڪ ۽ ATP پيداوار ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾ (شڪل 3A، B)، جڏهن ته بايو اينرجٽڪ هيلٿ انڊيڪس (BHI) تبديل نه ٿيو.
IPA LX-2 سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل تنفس کي گھٽائي ٿو. مائيٽوڪونڊريل تنفس وکر (OCR) کي مائيٽوڪونڊريل تنفس پيرا ميٽرز (غير مائيٽوڪونڊريل تنفس، بيسل تنفس، وڌ ۾ وڌ تنفس، پروٽون ليڪ، ATP نسل، SRC ۽ BHI) طور پيش ڪيو ويو آهي. سيلز A ۽ B کي ترتيب وار 10 μM، 100 μM ۽ 1 mM IPA سان 24 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. سيلز C ۽ D کي ترتيب وار TGF-β1 (5 ng/ml) ۽ 1 mM IPA سان سيرم فري ميڊيم ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. سڀني ماپن کي CyQuant ڪٽ استعمال ڪندي DNA مواد تي نارمل ڪيو ويو. BHI: بايو اينرجٽڪ هيلٿ انڊيڪس؛ SRC: تنفس جي رزرو گنجائش؛ OCR: آڪسيجن جي استعمال جي شرح. ڊيٽا کي اوسط ± معياري انحراف (SD)، n = 5 آزاد تجربن جي طور تي پيش ڪيو ويو آهي. شمارياتي مقابلو هڪ طرفي ANOVA ۽ بونفروني پوسٽ هاڪ ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. *p < 0.05; **p < 0.01; ۽ ***p < 0.001
TGF-β1-فعال LX-2 سيلز جي بايو اينرجٽڪ پروفائل تي IPA جي اثر جي وڌيڪ جامع سمجھ حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان OCR (شڪل 3C، D) ذريعي مائيٽوڪونڊريل آڪسائيڊٽو فاسفوريليشن جو تجزيو ڪيو. نتيجن مان ظاهر ٿيو ته TGF-β1 علاج ڪنٽرول گروپ (شڪل 3C، D) جي مقابلي ۾ وڌ ۾ وڌ تنفس، تنفس جي ذخيري جي گنجائش (SRC) ۽ BHI کي گهٽائي سگهي ٿو. ان کان علاوه، گڏيل علاج بنيادي تنفس، پروٽون ليڪ ۽ ATP پيداوار کي گهٽائي ڇڏيو، پر SRC ۽ BHI TGF-β1 (شڪل 3C، D) سان علاج ڪيل ماڻهن کان خاص طور تي وڌيڪ هئا.
اسان سيهورس سافٽ ويئر پاران مهيا ڪيل "سيلولر انرجي فينوٽائپ ٽيسٽ" پڻ ڪيو (ضمني شڪل 4A-D). جيئن ضمني شڪل 3B ۾ ڏيکاريل آهي، TGF-β1 علاج کان پوءِ OCR ۽ ECAR ميٽابولڪ صلاحيتون ٻنهي ۾ گهٽتائي آئي، جڏهن ته، ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾ ميلاپ ۽ IPA علاج گروپن ۾ ڪو به فرق نه ڏٺو ويو. ان کان علاوه، ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾ ميلاپ ۽ IPA علاج کان پوءِ OCR جي بنيادي ۽ دٻاءُ جي سطح ٻنهي ۾ گهٽتائي آئي (ضمني شڪل 4C). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، ميلاپ جي علاج سان هڪجهڙائي جو نمونو ڏٺو ويو، جتي TGF-β1 علاج جي مقابلي ۾ ECAR جي بنيادي ۽ دٻاءُ جي سطحن ۾ ڪا به تبديلي نه ڏٺي وئي (ضمني شڪل 4C). HSCs ۾، TGF-β1 علاج جي نمائش کان پوءِ mitochondrial آڪسائيڊٽو فاسفوريليشن ۾ گهٽتائي ۽ SCR ۽ BHI کي بحال ڪرڻ لاءِ گڏيل علاج جي صلاحيت ميٽابولڪ صلاحيت (OCR ۽ ECAR) کي تبديل نه ڪيو. گڏ ڪيل، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته IPA HSCs ۾ بايو انرجيٽڪس کي گهٽائي سگھي ٿو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته IPA هڪ گهٽ توانائي واري پروفائل کي متاثر ڪري سگهي ٿو جيڪو HSC فينوٽائپ کي غير فعال ٿيڻ ڏانهن منتقل ڪري ٿو (ضمني شڪل 4D).
مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس تي IPA جي اثر جي جاچ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ نيٽ ورڪ ڪنيڪشن جي ٽن طرفي مقدار جي استعمال سان ڪئي وئي ۽ گڏوگڏ MTR اسٽيننگ (شڪل 4 ۽ ضمني شڪل 5). شڪل 4 ڏيکاري ٿو ته، ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾، TGF-β1 علاج اوسط سطح جي ايراضي، شاخ نمبر، ڪل شاخ جي ڊيگهه، ۽ شاخ جي جنڪشن نمبر (شڪل 4A ۽ B) کي گهٽائي ڇڏيو ۽ مائيٽوڪونڊريا جي تناسب کي گولائي کان وچولي مورفولوجي (شڪل 4C) ۾ تبديل ڪيو. صرف IPA علاج اوسط مائيٽوڪونڊريل حجم کي گهٽائي ڇڏيو ۽ ڪنٽرول گروپ (شڪل 4A) جي مقابلي ۾ مائيٽوڪونڊريا جي تناسب کي گولائي کان وچولي مورفولوجي ۾ تبديل ڪيو. ان جي ابتڙ، گولائي، اوسط شاخ جي ڊيگهه، ۽ مائيٽوڪونڊريل سرگرمي جيڪا مائيٽوڪونڊريل جھلي جي صلاحيت تي منحصر MTR (شڪل 4A ۽ E) پاران تشخيص ڪئي وئي هئي، تبديل نه ٿي ۽ اهي پيرا ميٽر گروپن جي وچ ۾ مختلف نه هئا. گڏ ڪيو وڃي، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته TGF-β1 ۽ IPA علاج مائيٽوڪونڊريل شڪل ۽ سائيز سان گڏو گڏ جاندار LX-2 سيلز ۾ نيٽ ورڪ پيچيدگي کي تبديل ڪرڻ لاءِ ظاهر ٿين ٿا.
IPA LX-2 سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊي اين اي جي گهڻائي کي تبديل ڪري ٿو. الف. سيرم فري ميڊيم ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ TGF-β1 (5 ng/ml) ۽ 1 mM IPA سان انڪيوبيٽ ٿيل لائيو LX-2 سيلز جون نمائندي ڪنفوڪل تصويرون جيڪي Mitotracker™ Red CMXRos سان داغدار ۽ DAPI سان نيرو داغدار مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ ڏيکارين ٿيون. سڀني ڊيٽا ۾ هر گروپ ۾ گهٽ ۾ گهٽ 15 تصويرون شامل آهن. اسان هر نموني جي قسم لاءِ 10 Z-اسٽيڪ تصويرون حاصل ڪيون. هر Z-محور جي ترتيب ۾ 30 سلائسون هيون، هر هڪ جي ٿولهه 9.86 μm هئي. اسڪيل بار: 10 μm. ب. تصوير تي موافقت واري حد کي لاڳو ڪندي سڃاڻپ ڪيل نمائندي شيون (صرف mitochondria). هر گروپ ۾ سڀني سيلز لاءِ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجيڪل نيٽ ورڪ ڪنيڪشن جو مقداري تجزيو ۽ مقابلو ڪيو ويو. ج. مائيٽوڪونڊريل شڪل جي تناسب جي تعدد. 0 جي ويجهو قدر گول شڪلن کي ظاهر ڪن ٿا، ۽ 1 جي ويجهو قدر فليمينٽس شڪلن کي ظاهر ڪن ٿا. D Mitochondrial DNA (mtDNA) مواد کي مواد ۽ طريقن ۾ بيان ڪيل طور تي طئي ڪيو ويو. E Mitotracker™ Red CMXRos تجزيو فلو سائٽوميٽري (30,000 واقعا) ذريعي ڪيو ويو جيئن مواد ۽ طريقن ۾ بيان ڪيو ويو آهي. ڊيٽا کي اوسط ± SD، n = 3 آزاد تجربن جي طور تي پيش ڪيو ويو آهي. شمارياتي مقابلو هڪ طرفي ANOVA ۽ بونفروني پوسٽ هاڪ ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
پوءِ اسان LX-2 سيلز ۾ mtDNA مواد جو تجزيو ڪيو جيئن ته مائيٽوڪونڊريل نمبر جو اشارو. ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾، TGF-β1-علاج ٿيل گروپ ۾ mtDNA مواد وڌايو ويو (شڪل 4D). TGF-β1-علاج ٿيل گروپ جي مقابلي ۾، mtDNA مواد گڏيل علاج گروپ (شڪل 4D) ۾ گهٽجي ويو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته IPA mtDNA مواد کي گهٽائي سگھي ٿو ۽ ممڪن طور تي مائيٽوڪونڊريل نمبر سان گڏ مائيٽوڪونڊريل تنفس (شڪل 3C). ان کان علاوه، IPA گڏيل علاج ۾ mtDNA مواد کي گهٽائيندي نظر آئي پر MTR-ثالثي مائيٽوڪونڊريل سرگرمي کي متاثر نه ڪيو (شڪل 4A-C).
اسان LX-2 سيلز ۾ فائبروسس، اپوپٽوسس، بقا، ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس سان لاڳاپيل جين جي mRNA سطحن سان IPA جي وابستگي جي جاچ ڪئي (شڪل 5A-D). ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾، TGF-β1-علاج ٿيل گروپ ڪوليجن ٽائپ I α2 چين (COL1A2)، α-سموٿ عضلاتي ايڪٽين (αSMA)، ميٽرڪس ميٽلوپروٽينيز 2 (MMP2)، ميٽلوپروٽينيز 1 (TIMP1) جو ٽشو انبيٽر، ۽ ڊائنامين 1-جهڙو جين (DRP1) جهڙن جين جي وڌندڙ اظهار کي ڏيکاريو، جيڪو فائبروسس ۽ چالو ڪرڻ ۾ واڌ کي ظاهر ڪري ٿو. ان کان علاوه، ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾، TGF-β1 علاج نيوڪليئر پريگنين ايڪس ريڪٽر (PXR)، ڪيسپيس 8 (CASP8)، MAPKAPK3، بي-سيل α جو انبيٽر، نيوڪليئر فيڪٽر κ جين لائيٽ پيپٽائڊ (NFκB1A) جو انبيٽر، ۽ نيوڪليئر فيڪٽر κB ڪائناز سب يونٽ β (IKBKB) جو انبيٽر جي mRNA سطح کي گهٽائي ڇڏيو (شڪل 5A-D). TGF-β1 علاج جي مقابلي ۾، TGF-β1 ۽ IPA سان گڏيل علاج COL1A2 ۽ MMP2 جي اظهار کي گهٽايو، پر PXR، TIMP1، B-cell lymphoma-2 (BCL-2)، CASP8، NFκB1A، NFκB1-β، ۽ IKBKB جي mRNA سطحن کي وڌايو. IPA علاج MMP2، Bcl-2 سان لاڳاپيل پروٽين X (BAX)، AKT1، آپٽڪ ايٽروفي پروٽين 1 (OPA1)، ۽ مائيٽوڪونڊريل فيوزن پروٽين 2 (MFN2) جي اظهار کي خاص طور تي گهٽايو، جڏهن ته CASP8، NFκB1A، NFκB1B، ۽ IKBKB جي اظهار کي ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾ وڌايو ويو. بهرحال، ڪيسپيس-3 (CASP3)، اپوپٽوٽڪ پيپٽيڊيس ايڪٽيويٽ ڪرڻ وارو عنصر 1 (APAF1)، مائيٽوڪونڊريل فيوزن پروٽين 1 (MFN1)، ۽ فيشن پروٽين 1 (FIS1) جي اظهار ۾ ڪو به فرق نه مليو. مجموعي طور تي، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته IPA علاج فائبروسس، اپوپٽوسس، بقا، ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس سان لاڳاپيل جين جي اظهار کي تبديل ڪري ٿو. اسان جو ڊيٽا مشورو ڏئي ٿو ته IPA علاج LX-2 سيلز ۾ فائبروسس کي گھٽائي ٿو؛ ساڳئي وقت، اهو فينوٽائپ کي غير فعال ٿيڻ ڏانهن منتقل ڪندي بقا کي متحرڪ ڪري ٿو.
IPA LX-2 سيلز ۾ فائبروبلاسٽ، اپوپٽوٽڪ، وائيبلٽي، ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جينز جي اظهار کي ماڊل ڪري ٿو. هسٽوگرام 24 ڪلاڪن لاءِ سيرم فري ميڊيم ۾ TGF-β1 ۽ IPA سان LX-2 سيلز کي شامل ڪرڻ کان پوءِ اينڊوجينس ڪنٽرول (RPLP0 يا PPIA) جي نسبت mRNA اظهار ڏيکاري ٿو. A فائبروبلاسٽ کي ظاهر ڪري ٿو، B اپوپٽوٽڪ سيلز کي ظاهر ڪري ٿو، C بچيل سيلز کي ظاهر ڪري ٿو، ۽ D مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جين اظهار کي ظاهر ڪري ٿو. ڊيٽا کي اوسط ± معياري انحراف (SD)، n = 3 آزاد تجربن جي طور تي پيش ڪيو ويو آهي. شمارياتي مقابلو هڪ طرفي ANOVA ۽ بونفروني پوسٽ هاڪ ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
پوءِ، سيل سائيز (FSC-H) ۽ سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي (SSC-H) ۾ تبديلين جو جائزو فلو سائيٽوميٽري (شڪل 6A،B) ذريعي ڪيو ويو، ۽ IPA علاج کان پوءِ سيل مورفولوجي ۾ تبديلين جو جائزو ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپي (TEM) ۽ فيز ڪنٽراسٽ مائڪروسڪوپي (ضمني شڪل 6A-B) ذريعي ڪيو ويو. جيئن توقع ڪئي وئي، TGF-β1-علاج ٿيل گروپ ۾ سيلز ڪنٽرول گروپ (شڪل 6A،B) جي مقابلي ۾ سائيز ۾ وڌيا، جيڪو رف اينڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم (ER*) ۽ فيگوليسوسومز (P) جي ڪلاسيڪل توسيع کي ڏيکاري ٿو، جيڪو هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيل (HSC) چالو ڪرڻ (ضمني شڪل 6A) کي ظاهر ڪري ٿو. بهرحال، TGF-β1-علاج ٿيل گروپ جي مقابلي ۾، سيل سائيز، سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي (شڪل 6A،B)، ۽ ER* مواد TGF-β1 ۽ IPA ميلاپ علاج گروپ (ضمني شڪل 6A) ۾ گهٽجي ويا. وڌيڪ، IPA علاج ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾ سيل سائيز، سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي (شڪل 6A، B)، P ۽ ER* مواد (ضمني شڪل 6A) کي گهٽائي ڇڏيو. ان کان علاوه، ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾ IPA علاج جي 24 ڪلاڪن کان پوءِ اپوپٽوٽڪ سيلز جو مواد وڌي ويو (اڇو تير، ضمني شڪل 6B). مجموعي طور تي، اهي نتيجا تجويز ڪن ٿا ته 1 mM IPA HSC apoptosis کي متحرڪ ڪري سگهي ٿو ۽ TGF-β1 پاران پيدا ڪيل سيل مورفولوجيڪل پيرا ميٽرز ۾ تبديلين کي رد ڪري سگهي ٿو، انهي ڪري سيل سائيز ۽ پيچيدگي کي منظم ڪري ٿو، جيڪو HSC غير فعال ٿيڻ سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو.
IPA LX-2 سيلز ۾ سيل سائيز ۽ سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي کي تبديل ڪري ٿو. فلو سائيٽوميٽري تجزيي جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون. تجزيي ۾ LX-2 سيلز لاءِ مخصوص گيٽنگ حڪمت عملي استعمال ڪئي وئي: سيل آبادي کي بيان ڪرڻ لاءِ SSC-A/FSC-A، ڊبلٽس جي سڃاڻپ لاءِ FSC-H/FSC-A، ۽ سيل سائيز ۽ پيچيدگي جي تجزيي لاءِ SSC-H/FSC-H. سيلز کي 24 ڪلاڪن لاءِ سيرم فري ميڊيم ۾ TGF-β1 (5 ng/ml) ۽ 1 mM IPA سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. LX-2 سيلز کي هيٺين کاٻي ڪواڊرنٽ (SSC-H-/FSC-H-)، مٿي کاٻي ڪواڊرنٽ (SSC-H+/FSC-H-)، هيٺيون ساڄي ڪواڊرنٽ (SSC-H-/FSC-H+)، ۽ مٿي ساڄي ڪواڊرنٽ (SSC-H+/FSC-H+) ۾ سيل سائيز ۽ سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي جي تجزيي لاءِ ورهايو ويو. ب. سيل مورفولوجي جو تجزيو فلو سائيٽوميٽري ذريعي FSC-H (فارورڊ اسڪيٽر، سيل سائيز) ۽ SSC-H (سائڊ اسڪيٽر، سائيٽوپلاسمڪ پيچيدگي) (30,000 واقعا) استعمال ڪندي ڪيو ويو. ڊيٽا کي اوسط ± SD، n = 3 آزاد تجربن جي طور تي پيش ڪيو ويو آهي. شمارياتي مقابلو هڪ طرفي ANOVA ۽ بونفروني پوسٽ هاڪ ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ۽ ****p < 0.0001
IPA جهڙا گٽ ميٽابولائٽس تحقيق جو هڪ گرم موضوع بڻجي چڪا آهن، جيڪي اهو مشورو ڏين ٿا ته گٽ مائڪرو بايوٽا ۾ نوان هدف ڳولي سگهجن ٿا. تنهن ڪري اهو دلچسپ آهي ته IPA، هڪ ميٽابولائٽ جيڪو اسان انسانن ۾ جگر جي فائبروسس سان ڳنڍيو آهي [15]، جانورن جي ماڊلز ۾ هڪ امڪاني اينٽي فائبروٽڪ مرڪب طور ڏيکاريو ويو آهي [13، 14]. هتي، اسان پهريون ڀيرو سيرم IPA ۽ گلوبل ليور ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ ڊي اين اي ميٿيليشن جي وچ ۾ هڪ ايسوسيئيشن جو مظاهرو ڪريون ٿا بغير ٽائپ 2 ذیابيطس (T2D) جي موهيندڙ ماڻهن ۾، اپوپٽوسس، مائيٽوفگي ۽ ڊگهي عمر کي اجاگر ڪندي، انهي سان گڏ هڪ ممڪن اميدوار جين AKT1 جگر جي هوميوسٽاسس کي منظم ڪندي. اسان جي مطالعي جي هڪ ٻي نئين ڳالهه اها آهي ته اسان LX-2 سيلز ۾ اپوپٽوسس، سيل مورفولوجي، مائيٽوڪونڊريل بايو اينرجيٽڪس ۽ ڊائنامڪس سان IPA علاج جي رابطي جو مظاهرو ڪيو، هڪ گهٽ توانائي اسپيڪٽرم کي ظاهر ڪري ٿو جيڪو HSC فينوٽائپ کي غير فعال ٿيڻ ڏانهن منتقل ڪري ٿو، IPA کي جگر جي فائبروسس کي بهتر ڪرڻ لاءِ هڪ امڪاني اميدوار بڻائي ٿو.
اسان ڏٺو ته گردش ڪندڙ سيرم IPA سان لاڳاپيل جگر جي جين ۾ افزوده ٿيندڙ سڀ کان اهم ڪيننيڪل رستا اپوپٽوسس، مائيٽوڪونڊريل ڪوالٽي ڪنٽرول (MQC) سسٽم جي خلل مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن، مائيٽوڪونڊريل ۽ اپوپٽوسس جو سبب بڻجي سگهي ٿو، ان ڪري MASLD جي موجودگي کي فروغ ڏئي ٿو [33، 34]. تنهن ڪري، اسان اندازو لڳائي سگهون ٿا ته IPA جگر ۾ اپوپٽوسس، مائيٽوڪونڊريل ۽ ڊگهي عمر ذريعي سيل جي متحرڪ ۽ مائيٽوڪونڊريل سالميت کي برقرار رکڻ ۾ شامل ٿي سگهي ٿو. اسان جي ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته ٽنهي اسيسز ۾ ٻه جين عام هئا: YKT6 ۽ AKT1. اهو قابل ذڪر آهي ته YKT6 هڪ SNARE پروٽين آهي جيڪو سيل جھلي فيوزن جي عمل ۾ شامل آهي. اهو آٽوفيگوسوم تي STX17 ۽ SNAP29 سان هڪ شروعاتي ڪمپليڪس ٺاهي آٽوفيگي ۽ مائيٽوفيگي ۾ ڪردار ادا ڪري ٿو، ان ڪري آٽوفيگوسوم ۽ لائسوسومس جي فيوزن کي فروغ ڏئي ٿو [35]. وڌيڪ، YKT6 فنڪشن جي نقصان جي نتيجي ۾ خراب ٿيل mitophagy [36] آهي، جڏهن ته YKT6 جي اپ ريگيوليشن هيپاٽو سيلولر ڪارڪينوما (HCC) جي ترقي سان لاڳاپيل آهي، جيڪو سيل جي بقا ۾ اضافو ڏيکاري ٿو [37]. ٻئي طرف، AKT1 سڀ کان اهم رابطي ڪندڙ جين آهي ۽ جگر جي بيمارين ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو، جنهن ۾ PI3K/AKT سگنلنگ رستو، سيل چڪر، سيل جي منتقلي، واڌ، فوڪل ايڊهيشن، مائيٽوڪونڊريل فنڪشن، ۽ ڪوليجن سيڪريشن [38-40] شامل آهن. چالو ٿيل PI3K/AKT سگنلنگ رستو هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيلز (HSCs) کي چالو ڪري سگهي ٿو، جيڪي ايڪسٽرا سيلولر ميٽرڪس (ECM) جي پيداوار لاءِ ذميوار سيلز آهن، ۽ ان جي خرابي جگر فائبروسس جي موجودگي ۽ ترقي ۾ حصو وٺي سگهي ٿي [40]. ان کان علاوه، AKT اهم سيل جي بقا جي عنصرن مان هڪ آهي جيڪو p53-انحصار سيل اپوپٽوسس کي روڪي ٿو، ۽ AKT چالو جگر سيل اپوپٽوسس جي روڪٿام سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو [41، 42]. حاصل ڪيل نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته IPA جگر جي مائٽوڪونڊريا سان لاڳاپيل اپوپٽوسس ۾ شامل ٿي سگهي ٿو، هيپاٽوسائٽس جي اپوپٽوسس ۾ داخل ٿيڻ يا بقا جي وچ ۾ فيصلي کي متاثر ڪندي. اهي اثر AKT ۽/يا YKT6 اميدوار جينز ذريعي منظم ٿي سگهن ٿا، جيڪي جگر جي هوميوسٽاسس لاءِ اهم آهن.
اسان جي نتيجن مان ظاهر ٿيو ته 1 ايم ايم IPA اپوپٽوسس کي متاثر ڪيو ۽ TGF-β1 علاج کان آزاد LX-2 سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل تنفس ۾ گهٽتائي ڪئي. اهو قابل ذڪر آهي ته اپوپٽوسس فائبروسس ريزوليوشن ۽ هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيل (HSC) ايڪٽيويشن لاءِ هڪ اهم رستو آهي، ۽ جگر فائبروسس جي ريورسيبل فزيولوجيڪل ردعمل ۾ پڻ هڪ اهم واقعو آهي [4، 43]. ان کان علاوه، گڏيل علاج کان پوءِ LX-2 سيلز ۾ BHI جي بحالي مائيٽوڪونڊريل بايو اينرجيٽڪس جي ضابطي ۾ IPA جي امڪاني ڪردار ۾ نئين بصيرت فراهم ڪئي. آرام ۽ غير فعال حالتن ۾، هيماٽوپوئيٽڪ سيلز عام طور تي ATP پيدا ڪرڻ لاءِ مائيٽوڪونڊريل آڪسائيڊٽو فاسفوريليشن استعمال ڪندا آهن ۽ گهٽ ميٽابولڪ سرگرمي هوندي آهي. ٻئي طرف، HSC ايڪٽيويشن گلائڪونڊيريل تنفس ۽ بايو سنٿيسس کي وڌائيندو آهي ته جيئن گلائڪونڊيريل رياست ۾ داخل ٿيڻ جي توانائي جي گهرجن کي پورو ڪري سگهجي [44]. حقيقت اها آهي ته IPA ميٽابولڪ صلاحيت کي متاثر نه ڪيو ۽ ECAR اهو ظاهر ڪري ٿو ته گلائڪونڊيريل رستو گهٽ ترجيح ڏني وئي آهي. ساڳئي طرح، هڪ ٻي مطالعي مان ظاهر ٿيو ته 1 ايم ايم IPA ڪارڊيوميوسائٽس، انساني هيپاٽوسائيٽ سيل لائن (Huh7) ۽ انساني امبليڪل وين اينڊوٿيليل سيلز (HUVEC) ۾ مائيٽوڪونڊريل ريسپائريٽري چين سرگرمي کي ماڊل ڪرڻ جي قابل هو؛ جڏهن ته، ڪارڊيوميوسائٽس ۾ گلائڪوليسس تي IPA جو ڪو به اثر نه مليو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته IPA ٻين سيل قسمن جي بايو اينرجيٽڪس کي متاثر ڪري سگهي ٿو [45]. تنهن ڪري، اسان اندازو لڳايو ته 1 ايم ايم IPA هڪ نرم ڪيميائي انڪپلر جي طور تي ڪم ڪري سگهي ٿو، ڇاڪاڻ ته اهو mtDNA جي مقدار کي تبديل ڪرڻ کان سواءِ فائبروجينڪ جين اظهار، سيل مورفولوجي ۽ مائيٽوڪونڊريل بايو اينرجيٽڪس کي گهٽائي سگهي ٿو [46]. مائيٽوڪونڊريل انڪپلر ڪلچر-انڊيوسڊ فائبروسس ۽ HSC ايڪٽيويشن کي روڪي سگهن ٿا [47] ۽ مائيٽوڪونڊريل ATP پيداوار کي گهٽائي سگهن ٿا جيڪي ڪجهه پروٽين جهڙوڪ انڪپلنگ پروٽين (UCP) يا ايڊينائن نيوڪليوٽائيڊ ٽرانسلوڪيس (ANT) پاران منظم يا متاثر ٿيل آهن. سيل جي قسم تي منحصر ڪري، هي رجحان سيلز کي اپوپٽوسس کان بچائي سگهي ٿو ۽/يا اپوپٽوسس کي فروغ ڏئي سگهي ٿو [46]. جڏهن ته، هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيل جي غير فعال ٿيڻ ۾ مائيٽوڪونڊريل انڪپلر جي طور تي IPA جي ڪردار کي واضح ڪرڻ لاءِ وڌيڪ مطالعي جي ضرورت آهي.
پوءِ اسان تحقيق ڪئي ته ڇا مائيٽوڪونڊريل تنفس ۾ تبديليون زنده LX-2 سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۾ ظاهر ٿين ٿيون. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، TGF-β1 علاج مائيٽوڪونڊريل تناسب کي گول کان وچولي تائين تبديل ڪري ٿو، جنهن ۾ مائيٽوڪونڊريل برانچنگ ۾ گهٽتائي ۽ DRP1 جي اظهار ۾ واڌ ٿئي ٿي، جيڪو مائيٽوڪونڊريل فيشن ۾ هڪ اهم عنصر آهي [48]. ان کان علاوه، مائيٽوڪونڊريل فريگمينٽيشن مجموعي نيٽ ورڪ پيچيدگي سان لاڳاپيل آهي، ۽ فيوزن کان فيشن ۾ منتقلي هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيل (HSC) جي چالو ڪرڻ لاءِ اهم آهي، جڏهن ته مائيٽوڪونڊريل فيشن جي روڪٿام HSC اپوپٽوسس ڏانهن وٺي ٿي [49]. ان ڪري، اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته TGF-β1 علاج گهٽجي ويل برانچنگ سان مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ پيچيدگي ۾ گهٽتائي آڻي سگهي ٿو، جيڪو چالو ٿيل هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيلز (HSCs) سان لاڳاپيل مائيٽوڪونڊريل فيشن ۾ وڌيڪ عام آهي. ان کان علاوه، اسان جي ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته IPA مائيٽوڪونڊريل جي تناسب کي گول کان وچولي شڪل ۾ تبديل ڪري سگهي ٿو، ان ڪري OPA1 ۽ MFN2 جي اظهار کي گهٽائي سگهي ٿو. مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته OPA1 جي گهٽتائي مائيٽوڪونڊريل جھلي جي صلاحيت ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجي سگهي ٿي ۽ سيل اپوپٽوسس کي متحرڪ ڪري سگهي ٿي [50]. MFN2 کي مائيٽوڪونڊريل فيوزن ۽ اپوپٽوسس جي وچولي ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو [51]. حاصل ڪيل نتيجا اهو ظاهر ڪن ٿا ته TGF-β1 ۽/يا IPA پاران LX-2 سيلز جي شموليت مائيٽوڪونڊريل شڪل ۽ سائيز، انهي سان گڏ ايڪٽيويشن اسٽيٽ ۽ نيٽ ورڪ پيچيدگي کي تبديل ڪندي نظر اچي ٿي.
اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته TGFβ-1 ۽ IPA جو گڏيل علاج اپوپٽوسس کان بچڻ واري سيلز ۾ فائبروسس، اپوپٽوسس ۽ بقا سان لاڳاپيل جين جي mRNA اظهار کي منظم ڪندي mtDNA ۽ سيل مورفولوجيڪل پيرا ميٽرز کي گهٽائي سگهي ٿو. حقيقت ۾، IPA AKT1 جي mRNA اظهار جي سطح ۽ COL1A2 ۽ MMP2 جهڙن اهم فائبروسس جين کي گهٽايو، پر CASP8 جي اظهار جي سطح کي وڌايو، جيڪو اپوپٽوسس سان لاڳاپيل آهي. اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته IPA علاج کان پوءِ، BAX اظهار گهٽجي ويو ۽ TIMP1 فيملي سب يونٽس، BCL-2 ۽ NF-κB جو mRNA اظهار وڌي ويو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته IPA هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيلز (HSCs) ۾ بقا جي سگنلن کي متحرڪ ڪري سگهي ٿو جيڪي اپوپٽوسس کان بچي وڃن ٿا. اهي ماليڪيول چالو ٿيل هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيلز ۾ پرو-بقا سگنل طور ڪم ڪري سگهن ٿا، جيڪو اينٽي-اپوپٽوٽڪ پروٽين (جهڙوڪ Bcl-2) جي وڌندڙ اظهار سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو، پرو-اپوپٽوٽڪ BAX جي گهٽ اظهار، ۽ TIMP ۽ NF-κB جي وچ ۾ هڪ پيچيده انٽرپلي [5، 7]. IPA PXR ذريعي پنهنجا اثر ڏيکاري ٿو، ۽ اسان ڏٺو ته TGF-β1 ۽ IPA سان ميلاپ علاج PXR mRNA اظهار جي سطح کي وڌايو، جيڪو HSC چالو ڪرڻ جي دٻاءُ کي ظاهر ڪري ٿو. چالو PXR سگنلنگ ٻنهي ۾ vivo ۽ in vitro [52، 53] ۾ HSC چالو ڪرڻ کي روڪڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو. اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته IPA apoptosis کي فروغ ڏيڻ، fibrosis ۽ mitochondrial metabolism کي گهٽائڻ، ۽ بقا جي سگنلن کي وڌائڻ سان چالو HSCs جي صفائي ۾ حصو وٺي سگھي ٿو، جيڪي عام عمل آهن جيڪي چالو HSC فينوٽائپ کي هڪ غير فعال ۾ تبديل ڪن ٿا. apoptosis ۾ IPA جي امڪاني ميڪانيزم ۽ ڪردار لاءِ هڪ ٻي ممڪن وضاحت اها آهي ته اهو بنيادي طور تي mitophagy (اندروني رستو) ۽ خارجي TNF سگنلنگ رستو (ٽيبل 1) ذريعي غير فعال مائيٽوڪونڊريا کي صاف ڪري ٿو، جيڪو سڌو سنئون NF-κB بقا سگنلنگ رستو (ضمني شڪل 7) سان ڳنڍيل آهي. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، IPA سان لاڳاپيل افزوده جين اپوپٽوٽڪ رستي ۾ پرو-اپوپٽوٽڪ ۽ پرو-بقا سگنل پيدا ڪرڻ جي قابل آهن [54]، اهو مشورو ڏئي ٿو ته IPA انهن جين سان لهه وچڙ ڪندي اپوپٽوٽڪ رستي يا بقا کي متاثر ڪري سگهي ٿو. بهرحال، HSC چالو ڪرڻ دوران IPA اپوپٽوسس يا بقا کي ڪيئن متاثر ڪري ٿو ۽ ان جا ميڪانياتي رستا واضح نه آهن.
IPA هڪ مائڪروبيل ميٽابولائٽ آهي جيڪو آنڊن جي مائڪرو بايوٽا ذريعي غذائي ٽرپٽوفن مان ٺهيل آهي. مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته ان ۾ آنڊن جي ماحول ۾ سوزش مخالف، اينٽي آڪسيڊنٽ، ۽ ايپي جينيٽڪ ريگيوليٽري خاصيتون آهن. [55] مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته IPA آنڊن جي رڪاوٽ جي ڪم کي تبديل ڪري سگهي ٿو ۽ آڪسائيڊيوٽ دٻاءُ کي گهٽائي سگهي ٿو، جيڪو ان جي مقامي جسماني اثرات ۾ حصو وٺي سگهي ٿو. [56] حقيقت ۾، IPA گردش ذريعي نشانو بڻايل عضون ڏانهن منتقل ڪيو ويندو آهي، ۽ جيئن ته IPA ٽرپٽوفن، سيروٽونين، ۽ انڊول ڊيريويٽيوز سان هڪجهڙائي واري وڏي ميٽابولائٽ structure کي حصيداري ڪري ٿو، IPA ميٽابولڪ ڪارناما انجام ڏئي ٿو جنهن جي نتيجي ۾ مقابلي واري ميٽابولڪ قسمت پيدا ٿئي ٿي. [52] IPA اينزائمز يا ريڪٽرز تي پابند سائيٽن لاءِ ٽرپٽوفن مان نڪتل ميٽابولائٽس سان مقابلو ڪري سگهي ٿو، ممڪن طور تي عام ميٽابولڪ رستن کي خراب ڪري ٿو. اهو ان جي علاج واري ونڊو کي بهتر سمجهڻ لاءِ ان جي فارماڪوڪائنيٽڪس ۽ فارماڪوڊائنامڪس تي وڌيڪ مطالعي جي ضرورت کي اجاگر ڪري ٿو. [57] اهو ڏسڻو آهي ته ڇا اهو هيماتوپوئٽڪ اسٽيم سيلز (HSCs) ۾ پڻ ٿي سگهي ٿو.
اسان تسليم ڪريون ٿا ته اسان جي مطالعي ۾ ڪجهه حدون آهن. خاص طور تي IPA سان لاڳاپيل ايسوسيئيشن جي جانچ ڪرڻ لاءِ، اسان ٽائپ 2 ذیابيطس ميليٽس (T2DM) وارن مريضن کي خارج ڪيو. اسان تسليم ڪريون ٿا ته هي ٽائپ 2 ذیابيطس ميليٽس ۽ ترقي يافته جگر جي بيماري وارن مريضن تي اسان جي نتيجن جي وسيع لاڳو ٿيڻ کي محدود ڪري ٿو. جيتوڻيڪ انساني سيرم ۾ IPA جي جسماني ڪنسنٽريشن 1-10 μM [11، 20] آهي، 1 mM IPA جي ڪنسنٽريشن کي سڀ کان وڌيڪ غير زهر ڪنسنٽريشن [15] ۽ اپوپٽوسس جي بلند ترين شرح جي بنياد تي چونڊيو ويو، جنهن ۾ نيڪروٽڪ سيل آبادي جي سيڪڙو ۾ ڪو فرق نه هو. جيتوڻيڪ هن مطالعي ۾ IPA جي سپرافزيولوجيڪل سطحون استعمال ڪيون ويون، في الحال IPA جي اثرائتي دوز جي حوالي سان ڪو به اتفاق راءِ ناهي [52]. جيتوڻيڪ اسان جا نتيجا اهم آهن، IPA جي وسيع ميٽابولڪ قسمت تحقيق جو هڪ سرگرم علائقو رهي ٿي. ان کان علاوه، سيرم IPA جي سطحن ۽ جگر جي ٽرانسڪرپٽس جي DNA ميٿيليشن جي وچ ۾ ايسوسيئيشن تي اسان جا نتيجا نه رڳو هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيلز (HSCs) مان حاصل ڪيا ويا پر جگر جي ٽشوز مان پڻ. اسان انساني LX-2 سيلز کي استعمال ڪرڻ جو انتخاب ڪيو آهي اسان جي ٽرانسڪرپٽومي تجزيي مان اسان جي پوئين نتيجن جي بنياد تي ته IPA هيماٽوپوئيٽڪ اسٽيم سيل (HSC) ايڪٽيويشن سان لاڳاپيل آهي [15]، ۽ HSCs جگر جي فائبروسس جي ترقي ۾ شامل اهم سيلز آهن. جگر ڪيترن ئي سيل قسمن تي مشتمل آهي، تنهن ڪري ٻيا سيل ماڊل جهڙوڪ هيپاٽوسائيٽ-HSC- مدافعتي سيل ڪو ڪلچر سسٽم ڪيسپيس ايڪٽيويشن ۽ ڊي اين اي فريگمينٽيشن سان گڏ گڏوگڏ عمل جي ميڪانيزم سميت پروٽين جي سطح تي غور ڪيو وڃي ته جيئن IPA جي ڪردار ۽ ٻين جگر جي سيل قسمن سان ان جي رابطي جو مطالعو ڪيو وڃي.