هي مضمون تحقيقي موضوع جو حصو آهي "پيٿوجنز ۽ آفتن جي خلاف ڀاڄين جي مزاحمت کي بهتر بڻائڻ"، سڀئي 5 مضمون ڏسو.
فنگل ٻوٽن جي بيماري necrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary جو ڪارڻ ايجنٽ مختلف ميزبان ٻوٽن کي متاثر ڪرڻ لاءِ هڪ گھڻ-ٽائر واري حڪمت عملي استعمال ڪري ٿو. هي مطالعو ڊائامين L-ornithine جي استعمال جي تجويز پيش ڪري ٿو، هڪ غير پروٽين امينو ايسڊ جيڪو ٻين ضروري امينو ايسڊ جي ترکیب کي متحرڪ ڪري ٿو، هڪ متبادل انتظام جي حڪمت عملي جي طور تي Phaseolus vulgaris L. جي ماليڪيولر، جسماني ۽ بايو ڪيميڪل ردعمل کي وڌائڻ لاءِ Pseudomonas sclerotiorum جي ڪري اڇي ڦڦڙ ڏانهن. ان ويٽرو تجربن مان ظاهر ٿيو ته L-ornithine خوراک تي منحصر انداز ۾ S. pyrenoidosa جي mycelial واڌ کي خاص طور تي روڪيو. ان کان علاوه، اهو گرين هائوس حالتن ۾ اڇي ڦڦڙ جي شدت کي خاص طور تي گهٽائي سگهي ٿو. ان کان علاوه، L-ornithine علاج ٿيل ٻوٽن جي واڌ کي متحرڪ ڪيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته L-ornithine جي آزمائشي ڪنسنٽريشن علاج ٿيل ٻوٽن لاءِ فائٽوٽوڪسڪ نه هئي. ان کان علاوه، L-ornithine غير اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽس (مڪمل حل ٿيندڙ فينولڪس ۽ فليونوائيڊس) ۽ اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽس (ڪيٽيليس (CAT)، پيرو آڪسائيڊس (POX)، ۽ پولي فينول آڪسائيڊس (PPO)) جي اظهار کي وڌايو، ۽ ٽن اينٽي آڪسيڊنٽ سان لاڳاپيل جينز (PvCAT1، PvSOD، ۽ PvGR) جي اظهار کي وڌايو. ان کان علاوه، سليڪو تجزيي ۾ S. sclerotiorum جينوم ۾ هڪ پوٽيٽو آڪسالواسيٽيٽ ايسٽيل هائيڊروليز (SsOAH) پروٽين جي موجودگي ظاهر ڪئي، جيڪا فنڪشنل تجزيو، محفوظ ڊومينز، ۽ ٽوپولوجي جي لحاظ کان Aspergillus fijiensis (AfOAH) ۽ Penicillium sp. (PlOAH) جي آڪسالواسيٽيٽ ايسٽيل هائيڊروليز (SsOAH) پروٽين سان تمام گهڻي مشابهت رکي ٿي. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته آلو ڊيڪسٽروز برٿ (PDB) ميڊيم ۾ L-ornithine جي اضافي سان S. sclerotiorum mycelia ۾ SsOAH جين جي اظهار کي خاص طور تي گهٽايو ويو. ساڳئي طرح، علاج ٿيل ٻوٽن مان گڏ ڪيل فنگل مائيسيليا ۾ L-ornithine جي خارجي استعمال SsOAH جين جي اظهار کي گهٽائي ڇڏيو. آخرڪار، L-ornithine جي استعمال PDB وچولي ۽ متاثر ٿيل پنن ٻنهي ۾ آڪسالڪ ايسڊ جي رطوبت کي گهٽائي ڇڏيو. نتيجي ۾، L-ornithine ريڊوڪس حيثيت کي برقرار رکڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو ۽ متاثر ٿيل ٻوٽن جي دفاعي ردعمل کي وڌائي ٿو. هن مطالعي جا نتيجا اڇي ڦڦڙي کي ڪنٽرول ڪرڻ ۽ لوبيا جي پيداوار ۽ ٻين فصلن تي ان جي اثر کي گهٽائڻ لاءِ جديد، ماحول دوست طريقا تيار ڪرڻ ۾ مدد ڪري سگهن ٿا.
سفيد ڦڦڙ، جيڪو نيڪروٽروفڪ فنگس اسڪلروٽينيا اسڪليروٽيوريم (ليب.) ڊي بيري جي ڪري ٿئي ٿو، هڪ تباهي ڪندڙ، پيداوار گهٽائڻ واري بيماري آهي جيڪا عالمي لوبيا (فيزولس ولگارس ايل.) جي پيداوار لاءِ هڪ سنگين خطرو پيدا ڪري ٿي (بولٽن ۽ ٻيا، 2006). اسڪلروٽينيا اسڪليروٽيوريم مٽيءَ مان پيدا ٿيندڙ فنگل ٻوٽن جي پيٿوجنز مان هڪ آهي جنهن کي ڪنٽرول ڪرڻ تمام ڏکيو آهي، جنهن ۾ 600 کان وڌيڪ ٻوٽن جي نسلن جي وسيع ميزبان رينج ۽ غير مخصوص طريقي سان ميزبان ٽشوز کي تيزيءَ سان ميڪريٽ ڪرڻ جي صلاحيت آهي (ليانگ ۽ رولنز، 2018). ناموافق حالتن ۾، اهو پنهنجي زندگي جي چڪر جي هڪ نازڪ مرحلي مان گذري ٿو، ڊگهي عرصي تائين مٽيءَ ۾ ڪاري، سخت، ٻج جهڙين بناوتن جي طور تي يا متاثر ٿيل ٻوٽن جي مائيسيليم يا اسٽيم پيٿ ۾ اڇي، ڦڦڙن جي واڌ جي طور تي (شوارٽز ۽ ٻيا، 2005). ايس. اسڪليروٽيوريم اسڪليروٽيا ٺاهڻ جي قابل آهي، جيڪو ان کي متاثر ٿيل ميدانن ۾ ڊگهي عرصي تائين زنده رهڻ ۽ بيماري دوران برقرار رهڻ جي اجازت ڏئي ٿو (شوارٽز ۽ ٻيا، 2005). اسڪليروٽيا غذائي اجزاء سان مالا مال آهن، ڊگهي عرصي تائين مٽي ۾ رهي سگهن ٿا، ۽ بعد ۾ انفيڪشن لاءِ بنيادي انوڪولم طور ڪم ڪن ٿا (شوارٽز ۽ ٻيا، 2005). سازگار حالتن ۾، اسڪليروٽيا اڀري ٿو ۽ هوائي اسپور پيدا ڪري ٿو جيڪي ٻوٽي جي سڀني مٿانهين زميني حصن کي متاثر ڪري سگهن ٿا، جن ۾ گلن، تنن، يا پوڊن سميت پر محدود نه آهن (شوارٽز ۽ ٻيا، 2005).
اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم پنهنجي ميزبان ٻوٽن کي متاثر ڪرڻ لاءِ هڪ گھڻ-سطحي حڪمت عملي استعمال ڪري ٿو، جنهن ۾ اسڪليروٽيل جراثيم کان وٺي علامتن جي ترقي تائين هم آهنگ واقعن جو هڪ سلسلو شامل آهي. شروعات ۾، ايس. اسڪليروٽيوريم مشروم جهڙين بناوتن مان معطل ٿيل اسپورس (اسڪوسپورس سڏيو ويندو آهي) پيدا ڪري ٿو جن کي اپوٿيسيا سڏيو ويندو آهي، جيڪي هوا ۾ تبديل ٿي ويندا آهن ۽ متاثر ٿيل ٻوٽن جي ملبي تي غير متحرڪ اسڪليروٽيا ۾ ترقي ڪندا آهن (بولٽن ۽ ٻيا، 2006). پوءِ فنگس آڪسالڪ ايسڊ، هڪ وائرلينس فيڪٽر کي خارج ڪري ٿو، ٻوٽي جي سيل وال پي ايڇ کي ڪنٽرول ڪرڻ، اينزيميٽڪ ڊيگريڊيشن ۽ ٽشو جي حملي کي فروغ ڏيڻ (هيگيڊس ۽ ريمر، 2005)، ۽ ميزبان ٻوٽي جي آڪسائيڊيوٽ برسٽ کي دٻائڻ لاءِ. هي تيزابيت وارو عمل ٻوٽي جي سيل وال کي ڪمزور ڪري ٿو، فنگل سيل وال ڊيگريڊنگ اينزائمز (CWDEs) جي عام ۽ موثر آپريشن لاءِ هڪ سازگار ماحول فراهم ڪري ٿو، جنهن سان پيٿوجن جسماني رڪاوٽ کي پار ڪري سگهي ٿو ۽ ميزبان ٽشوز ۾ داخل ٿي سگهي ٿو (مارسيانو ۽ ٻيا، 1983). هڪ ڀيرو داخل ٿيڻ کان پوءِ، ايس. اسڪليروٽيوريم ڪيترائي سي ڊبليو ڊي اي خارج ڪري ٿو، جهڙوڪ پولي گليڪٽورونيز ۽ سيلوليز، جيڪي متاثر ٿيل ٽشوز ۾ ان جي پکيڙ کي آسان بڻائين ٿا ۽ ٽشو نڪروسس جو سبب بڻجن ٿا. زخم ۽ هائفل ميٽ جي ترقي اڇي مولڊ جي خاصيت واري علامتن ڏانهن وٺي ٿي (هيگيڊس ۽ ريمر، 2005). ساڳئي وقت، ميزبان ٻوٽا پيٽروجن سان لاڳاپيل ماليڪيولر نمونن (PAMPs) کي پيٽرن جي سڃاڻپ ريڪٽرز (PRRs) ذريعي سڃاڻن ٿا، سگنلنگ واقعن جي هڪ سلسلي کي شروع ڪن ٿا جيڪي آخرڪار دفاعي ردعمل کي چالو ڪن ٿا.
ڏهاڪن کان بيماري جي ڪنٽرول جي ڪوششن جي باوجود، ٻين تجارتي فصلن وانگر، لوبيا ۾ مناسب مزاحمتي جراثيم جي کوٽ رهي ٿي، ڇاڪاڻ ته ان جي مزاحمت، بقا ۽ موافقت جي ڪري. تنهن ڪري، بيماري جو انتظام انتهائي چئلينجنگ آهي ۽ ان لاءِ هڪ مربوط، گهڻ رخي حڪمت عملي جي ضرورت آهي جنهن ۾ ثقافتي طريقا، حياتياتي ڪنٽرول، ۽ ڪيميائي فنگسائيڊس جو ميلاپ شامل آهي (O'Sullivan et al., 2021). اڇي ڦڦڙ جو ڪيميائي ڪنٽرول سڀ کان وڌيڪ اثرائتو آهي ڇاڪاڻ ته فنگسائيڊس، جڏهن صحيح ۽ صحيح وقت تي لاڳو ڪيا وڃن، ته اهي بيماري جي پکيڙ کي مؤثر طريقي سان ڪنٽرول ڪري سگهن ٿا، انفيڪشن جي شدت کي گهٽائي سگهن ٿا، ۽ پيداوار جي نقصان کي گهٽائي سگهن ٿا. بهرحال، فنگسائيڊس تي گهڻو استعمال ۽ وڌيڪ انحصار ايس. اسڪليروٽيوريم جي مزاحمتي قسمن جي ظهور جو سبب بڻجي سگهي ٿو ۽ غير نشانو جاندارن، مٽي جي صحت ۽ پاڻي جي معيار تي منفي اثر وجهي سگهي ٿو (لي ڪوئنٽي ۽ ٻيا، 2016؛ سيريسيني ۽ ٻيا، 2024). تنهن ڪري، ماحول دوست متبادل ڳولڻ هڪ اعليٰ ترجيح بڻجي وئي آهي.
پوليامائنز (PAs)، جهڙوڪ پوٽريسائن، اسپرمائيڊائن، اسپرمائن، ۽ ڪيڊاورين، مٽيءَ مان پيدا ٿيندڙ ٻوٽن جي پيٿوجنز جي خلاف واعدو ڪندڙ متبادل طور ڪم ڪري سگهن ٿا، ان ڪري خطرناڪ ڪيميائي فنگسائيڊز جي استعمال کي مڪمل طور تي يا جزوي طور تي گهٽائي سگهن ٿا (نيهلا ۽ ٻيا، 2024؛ يي ۽ ٻيا، 2024). اعليٰ ٻوٽن ۾، PAs ڪيترن ئي جسماني عملن ۾ شامل آهن، جن ۾ سيل ڊويزن، فرق، ۽ ابيوٽڪ ۽ بايوٽڪ دٻاءُ جو جواب شامل آهي، پر ان تائين محدود ناهي (ڪِلني ۽ نهيلا، 2020). اهي اينٽي آڪسيڊنٽ طور ڪم ڪري سگهن ٿا، رد عمل واري آڪسيجن اسپيشيز (ROS) کي صاف ڪرڻ ۾ مدد ڪن ٿا، ريڊوڪس هوميوسٽاسس برقرار رکن ٿا (نيهلا ۽ ڪليني، 2023)، دفاع سان لاڳاپيل جينز کي متاثر ڪن ٿا (روميرو ۽ ٻيا، 2018)، مختلف ميٽابولڪ رستن کي منظم ڪن ٿا (نيهلا ۽ ڪليني، 2023)، اينڊوجينس فائٽو هارمونز کي ماڊل ڪن ٿا (نيهلا ۽ ڪليني، 2019)، سسٽماتي حاصل ڪيل مزاحمت (SAR) قائم ڪن ٿا، ۽ ٻوٽن-پيٿوجن رابطي کي منظم ڪن ٿا (نيهلا ۽ ڪليني، 2020؛ آسيجا ۽ ٻيا، 2022؛ زيروونيڪ، 2022). اهو قابل ذڪر آهي ته ٻوٽن جي دفاع ۾ PAs جا مخصوص طريقا ۽ ڪردار ٻوٽن جي نسلن، پيٿوجنز، ۽ ماحولياتي حالتن جي لحاظ کان مختلف هوندا آهن. ٻوٽن ۾ سڀ کان وڌيڪ مقدار ۾ PA ضروري پوليامين L-ornithine (ڪيليني ۽ نيهلا، 2020) مان بايو سنٿيسائز ٿيل آهي.
ايل-اورنيٿائن ٻوٽن جي واڌ ۽ ترقي ۾ ڪيترائي ڪردار ادا ڪري ٿو. مثال طور، پوئين مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته چانورن ۾ (اوريزا سيٽيوا)، اورنيٿائن نائٽروجن ري سائيڪلنگ (ليو ۽ ٻيا، 2018)، چانورن جي پيداوار، معيار ۽ خوشبو (لو ۽ ٻيا، 2020)، ۽ پاڻي جي دٻاءُ جي رد عمل (يانگ ۽ ٻيا، 2000) سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو. ان کان علاوه، ايل-اورنيٿائن جي خارجي استعمال شگر بيٽ (بيٽا ولگارس) (حسين ۽ ٻيا، 2019) ۾ خشڪي جي برداشت کي خاص طور تي وڌايو ۽ پياز (ايليئم سيپا) (چاووسوو ۽ چاووسوو، 2021) ۽ ڪاجو (ايناڪارڊيم اوڪسيڊنٽيل) ٻوٽن (دا روچا ۽ ٻيا، 2012) ۾ لوڻ جي دٻاءُ کي گهٽايو. ابيوٽڪ دٻاءُ جي بچاءُ ۾ ايل-اورنيٿائن جو امڪاني ڪردار علاج ٿيل ٻوٽن ۾ پرولين جي جمع ٿيڻ ۾ ان جي شموليت جي ڪري ٿي سگهي ٿو. مثال طور، پرولين ميٽابولزم سان لاڳاپيل جين، جهڙوڪ اورنيٿائن ڊيلٽا امينوٽرانسفريز (ڊيلٽا-او اي ٽي) ۽ پرولين ڊيهائيڊروجنيز (پروڊي ايڇ 1 ۽ پروڊي ايڇ 2) جين، اڳ ۾ نڪوٽيانا بينٽاميانا ۽ عربيڊوپسس ٿاليانا جي غير ميزبان پسيودوموناس سرنجائي اسٽرين (سينٿل-ڪمار ۽ ميسور، 2012) جي خلاف دفاع ۾ شامل هجڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي. ٻئي طرف، فنگل اورنيٿائن ڊيڪاربوڪسيلس (او ڊي سي) پيٿوجن جي واڌ لاءِ ضروري آهي (سنگھ ۽ ٻيا، 2020). ميزبان-انڊيوسڊ جين سائليننگ (HIGS) ذريعي فوسيريم آڪسي اسپورم ايف. ايس پي. لائڪوپرسيسي جي او ڊي سي کي نشانو بڻائڻ سان ٽماٽو جي ٻوٽن جي فوسيريم وِلٽ (سنگھ ۽ ٻيا، 2020) جي مزاحمت کي خاص طور تي وڌايو ويو. بهرحال، فائٽوپيٿوجنز جهڙن بايوٽڪ دٻاءُ جي خلاف خارجي اورنيٿائن جي درخواست جي امڪاني ڪردار جو چڱي طرح مطالعو نه ڪيو ويو آهي. وڌيڪ اهم ڳالهه اها آهي ته، بيمارين جي مزاحمت تي اورنيٿائن جا اثر ۽ ان سان لاڳاپيل بايو ڪيميڪل ۽ جسماني رجحان وڏي حد تائين اڻ کُليل آهن.
مؤثر ڪنٽرول حڪمت عملين جي ترقي لاءِ ڀاڄين جي ايس اسڪليروٽيوريم انفيڪشن جي پيچيدگي کي سمجهڻ ضروري آهي. هن مطالعي ۾، اسان جو مقصد ڊائيامين ايل-آرنيٿائن جي امڪاني ڪردار کي سڃاڻپ ڪرڻ هو ته هڪ اهم عنصر جي طور تي ڀاڄين جي ٻوٽن جي دفاعي ميڪانيزم ۽ مزاحمت کي وڌائڻ ۾ Sclerotinia sclerotiorum انفيڪشن. اسان اهو فرض ڪريون ٿا ته، متاثر ٿيل ٻوٽن جي دفاعي ردعمل کي وڌائڻ کان علاوه، L-آرنيٿائن ريڊوڪس حيثيت کي برقرار رکڻ ۾ پڻ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو. اسان تجويز ڪريون ٿا ته L-آرنيٿائن جا امڪاني اثر اينزيميٽڪ ۽ غير اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽ دفاعي ميڪانيزم جي ضابطي ۽ فنگل پيٿوجينيٽي/وائرولينس فيڪٽرز ۽ لاڳاپيل پروٽين سان مداخلت سان لاڳاپيل آهن. L-آرنيٿائن جي هي ٻٽي ڪارڪردگي ان کي هڪ پائيدار حڪمت عملي لاءِ هڪ اميد افزا اميدوار بڻائي ٿي ته جيئن اڇي ڦڦڙن جي اثر کي گهٽائي سگهجي ۽ عام ڀاڄين جي فصلن جي مزاحمت کي هن طاقتور فنگل پيٿوجين جي خلاف وڌايو وڃي. موجوده مطالعي جا نتيجا اڇي ڦڦڙن کي ڪنٽرول ڪرڻ ۽ ڀاڄين جي پيداوار تي ان جي اثر کي گهٽائڻ لاءِ جديد، ماحول دوست طريقن جي ترقي ۾ مدد ڪري سگهن ٿا.
هن مطالعي ۾، عام لوبيا جي هڪ حساس تجارتي قسم، گيزا 3 (فيزولس ولگارس ايل. سي وي. گيزا 3)، کي تجرباتي مواد طور استعمال ڪيو ويو. صحتمند ٻج مهرباني ڪري ليگيوم ريسرچ ڊپارٽمينٽ، فيلڊ ڪراپس ريسرچ انسٽيٽيوٽ (ايف سي آر آءِ)، زرعي ريسرچ سينٽر (اي آر سي)، مصر پاران مهيا ڪيا ويا. پنج ٻج پلاسٽڪ جي ٿانون ۾ پوکيا ويا (اندروني قطر 35 سينٽي ميٽر، کوٽائي 50 سينٽي ميٽر) ايس. اسڪليروٽيوريم سان متاثر ٿيل مٽي سان ڀريل گرين هائوس حالتن ۾ (25 ± 2 °C، نسبتي نمي 75 ± 1%، 8 ڪلاڪ هلڪو/16 ڪلاڪ اونداهو). پوکڻ کان 7-10 ڏينهن بعد (ڊي پي ايس)، ٻج کي ٿلهو ڪيو ويو ته جيئن هر ٿانون ۾ هڪجهڙائي سان صرف ٻه ٻج ۽ ٽي مڪمل طور تي وڌايل پن رهجي وڃن. سڀني ٿانون ۾ رکيل ٻوٽن کي هر ٻن هفتن ۾ هڪ ڀيرو پاڻي ڏنو ويو ۽ ڏنل قسم لاءِ تجويز ڪيل شرح تي مهيني ۾ ڀاڻ ڏني وئي.
L-ornithinediamine (جنهن کي (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid؛ Sigma-Aldrich، Darmstadt، جرمني جي نالي سان پڻ سڃاتو وڃي ٿو) جي 500 mg/L ڪنسنٽريشن تيار ڪرڻ لاءِ، 50 mg پهريون ڀيرو 100 mL جراثيم کان پاڪ ڊسٽلڊ پاڻي ۾ حل ڪيو ويو. پوءِ اسٽاڪ محلول کي ملائي ڇڏيو ويو ۽ بعد ۾ تجربن ۾ استعمال ڪيو ويو. مختصر طور تي، L-ornithine ڪنسنٽريشن جي ڇهن سيريز (12.5، 25، 50، 75، 100، ۽ 125 mg/L) کي ويٽرو ۾ آزمايو ويو. ان کان علاوه، جراثيم کان پاڪ ڊسٽلڊ پاڻي کي منفي ڪنٽرول (Mock) طور استعمال ڪيو ويو ۽ ڪمرشل فنگسائيڊ "Rizolex-T" 50% ويٽيبل پائوڊر (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company، Kafr El Zayat، Gharbia Governorate، Egypt) کي مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. ڪمرشل فنگسائيڊ "ريزوليڪس-ٽي" کي پنج ڪنسنٽريشن (2، 4، 6، 8 ۽ 10 ملي گرام/ليٽر) تي ويٽرو ۾ آزمايو ويو.
عام لوبيا جي پاڙن ۽ ٻوٽن جا نمونا جيڪي اڇي ڦڦڙ جي عام علامتن کي ظاهر ڪن ٿا (آفت جي شرح: 10-30٪) تجارتي فارمن مان گڏ ڪيا ويا. جيتوڻيڪ گھڻا متاثر ٿيل ٻوٽا مواد نسلن/قسم (حساس تجارتي قسم گيزا 3) جي ذريعي سڃاڻپ ڪيا ويا، ٻيا، خاص طور تي جيڪي مقامي مارڪيٽن مان حاصل ڪيا ويا، اڻڄاتل نسلن جا هئا. گڏ ڪيل متاثر ٿيل مواد کي پهرين 3 منٽن لاءِ 0.5٪ سوڊيم هائپوڪلورائيٽ محلول سان مٿاڇري کي جراثيم ڪش ڪيو ويو، پوءِ جراثيم کان پاڪ ڊسٽل ٿيل پاڻي سان ڪيترائي ڀيرا ڌوئي ۽ اضافي پاڻي کي ڪڍڻ لاءِ جراثيم کان پاڪ فلٽر پيپر سان صاف ڪيو ويو. پوءِ متاثر ٿيل عضون کي وچين ٽشو (صحت مند ۽ متاثر ٿيل ٽشوز جي وچ ۾) مان ننڍن ٽڪرن ۾ ڪٽيو ويو، آلو ڊيڪسٽروز آگر (PDA) ميڊيم تي ڪلچر ڪيو ويو ۽ 25 ± 2 °C تي 12 ڪلاڪ روشني/12 ڪلاڪ ڊارڪ سائيڪل سان 5 ڏينهن تائين اسڪليروٽيا ٺهڻ کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. مائيسيليئل ٽِپ جو طريقو پڻ مخلوط يا آلوده ڪلچر مان فنگل آئسوليٽس کي صاف ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. صاف ٿيل فنگل آئسوليٽ کي پهريان ان جي ثقافتي مورفولوجيڪل خاصيتن جي بنياد تي سڃاڻپ ڪئي وئي ۽ پوءِ خوردبيني خاصيتن جي بنياد تي ايس. اسڪليروٽيوريم هجڻ جي تصديق ڪئي وئي. آخرڪار، ڪوچ جي پوسٽوليٽس کي پورا ڪرڻ لاءِ حساس عام بين ڪلٽيوار گيزا 3 تي سڀني صاف ٿيل آئسوليٽس کي پيٿوجينڪ جي جانچ ڪئي وئي.
ان کان علاوه، سڀ کان وڌيڪ ناگوار ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽ (آئسوليٽ #3) اندروني ٽرانسڪرائبڊ اسپيسر (ITS) سيڪوئنسنگ جي بنياد تي وڌيڪ تصديق ڪئي وئي جيئن وائيٽ ايٽ ال، 1990؛ بٽورو-سيزنيوسڪا ايٽ ال، 2017 پاران بيان ڪيو ويو آهي. مختصر طور تي، آئسوليٽس کي آلو ڊيڪسٽروس برٿ (PDB) ۾ ڪلچر ڪيو ويو ۽ 25 ± 2 °C تي 5-7 ڏينهن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. پوءِ فنگل مائيسيليم گڏ ڪيو ويو، چيز ڪلوٿ ذريعي فلٽر ڪيو ويو، جراثيم کان پاڪ پاڻي سان ٻه ڀيرا ڌوئي ويو، ۽ جراثيم کان پاڪ فلٽر پيپر سان خشڪ ڪيو ويو. جينومڪ ڊي اين اي کي ڪوئڪ-ڊي اين اي ™ فنگل/بيڪٽيريل مينيپريپ ڪٽ (ڪرامي-ايزيوڪا، 1997؛ عطاالله ايٽ ال، 2022، 2024) استعمال ڪندي الڳ ڪيو ويو. پوءِ ITS rDNA علائقي کي مخصوص پرائمر جوڙو ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC؛ متوقع سائيز: 540 bp) استعمال ڪندي وڌايو ويو (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). صاف ٿيل PCR پراڊڪٽس کي ترتيب ڏيڻ لاءِ جمع ڪرايو ويو (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA تسلسل کي سينجر تسلسل جي طريقي سان ٻه طرفي طور تي ترتيب ڏنو ويو. پوءِ گڏ ڪيل سوال جي تسلسل جو مقابلو GenBank ۽ نيشنل سينٽر فار بايو ٽيڪنالاجي انفارميشن (NCBI، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ۾ BLASTn سافٽ ويئر استعمال ڪندي تازي ڊيٽا سان ڪيو ويو. سوال جي تسلسل جو مقابلو 20 ٻين S. sclerotiorum strains/isolates سان ڪيو ويو جيڪي NCBI GenBank (سپليمينٽري ٽيبل S1) ۾ تازي ڊيٽا مان حاصل ڪيا ويا جيڪي ماليڪيولر ارتقائي جينياتي تجزيو پيڪيج (MEGA-11؛ ورجن 11) (Kumar et al., 2024) ۾ ClustalW استعمال ڪندي ڪيا ويا. ارتقائي تجزيو وڌ ۾ وڌ امڪان جي طريقي ۽ عام وقت جي بدلي ٿيندڙ نيوڪليوٽائيڊ متبادل ماڊل (ني ۽ ڪمار، 2000) استعمال ڪندي ڪيو ويو. سڀ کان وڌيڪ لاگ امڪان سان وڻ ڏيکاريو ويو آهي. هيورسٽڪ ڳولا لاءِ شروعاتي وڻ کي پاڙيسري سان شامل ٿيڻ واري (NJ) وڻ (ڪمار ۽ ٻيا، 2024) ۽ وڌ ۾ وڌ پارسيموني (MP) وڻ جي وچ ۾ وڌيڪ لاگ امڪان سان وڻ کي چونڊڻ سان چونڊيو ويو آهي. NJ وڻ کي عام وقت جي بدلي ٿيندڙ ماڊل (ني ۽ ڪمار، 2000) استعمال ڪندي حساب ڪيل هڪ جوڙي جي فاصلي واري ميٽرڪس استعمال ڪندي ٺاهيو ويو هو.
ايل-اورنيٿائن ۽ بيڪٽيريا مار دوا "ريزوليڪس-ٽي" جي اينٽي بيڪٽيريل سرگرمي آگر ڊفيوژن طريقي سان ويٽرو ۾ طئي ڪئي وئي. طريقو: ايل-اورنيٿائن جي اسٽاڪ محلول (500 ملي گرام/ليٽر) جي مناسب مقدار وٺو ۽ ان کي 10 ملي ليٽر پي ڊي اي غذائي ميڊيم سان چڱي طرح ملايو ته جيئن ترتيب وار 12.5، 25، 50، 75، 100 ۽ 125 ملي گرام/ليٽر جي آخري ڪنسنٽريشن سان حل تيار ڪري سگهجي. فنگسائيڊ "ريزوليڪس-ٽي" (2، 4، 6، 8 ۽ 10 ملي گرام/ليٽر) جي پنج ڪنسنٽريشن ۽ جراثيم کان پاڪ ڊسٽل پاڻي کي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. ميڊيم جي مضبوط ٿيڻ کان پوءِ، اسڪلروٽينيا اسڪليروٽيوريم ڪلچر جو هڪ تازو تيار ڪيل مائيسيليئل پلگ، 4 ملي ميٽر قطر، پيٽري ڊش جي مرڪز ڏانهن منتقل ڪيو ويو ۽ 25±2°C تي ڪلچر ڪيو ويو جيستائين مائيسيليم پوري ڪنٽرول پيٽري ڊش کي ڍڪي نه ڇڏيو، جنهن کان پوءِ فنگل جي واڌ رڪارڊ ڪئي وئي. مساوات 1 استعمال ڪندي ايس. اسڪليروٽيوريم جي ريڊيل واڌ جي فيصد جي روڪٿام جو حساب ڪريو:
تجربو ٻه ڀيرا ورجايو ويو، هر ڪنٽرول/تجرباتي گروپ لاءِ ڇهه حياتياتي نقل ۽ هر حياتياتي نقل لاءِ پنج ٿانو (ٻه ٻوٽا في ٿانو). هر حياتياتي نقل جو ٻه ڀيرا تجزيو ڪيو ويو (ٻه ٽيڪنيڪل نقل) تجرباتي نتيجن جي درستگي، اعتبار ۽ پيداوار کي يقيني بڻائڻ لاءِ. ان کان علاوه، پروبٽ ريگريشن تجزيو اڌ وڌ ۾ وڌ روڪڻ واري ڪنسنٽريشن (IC50) ۽ IC99 (پرينٽس، 1976) جي حساب لاءِ استعمال ڪيو ويو.
گرين هائوس حالتن ۾ ايل-اورنيٿائن جي صلاحيت جو جائزو وٺڻ لاءِ، ٻہ لڳاتار برتن تجربا ڪيا ويا. مختصر طور تي، برتنن کي جراثيم کان پاڪ مٽيءَ واري مٽيءَ (3:1) سان ڀريو ويو ۽ ايس. اسڪليروٽيوريم جي تازي تيار ڪيل ڪلچر سان انوڪيوليشن ڪئي وئي. پهرين، ايس. اسڪليروٽيوريم (آئسوليٽ #3) جي سڀ کان وڌيڪ ناگوار آئسوليٽ کي هڪ اسڪليروٽيم کي اڌ ۾ ڪٽي، ان کي پي ڊي اي تي منهن هيٺ رکي ۽ 25 ° C تي مسلسل اونداهي ۾ (24 ڪلاڪ) 4 ڏينهن تائين انڪيوبيٽ ڪندي ڪلچر ڪيو ويو ته جيئن مائيسيليئل واڌ کي تيز ڪري سگهجي. پوءِ چار 5 ملي ميٽر قطر جا آگر پلگ اڳئين ڪنڊ مان ڪڍيا ويا ۽ ڪڻڪ ۽ چانورن جي ڇلي جي 100 گرام جراثيم کان پاڪ مرکب (1:1، v/v) سان انوڪيوليشن ڪيا ويا ۽ سڀني فلاسڪس کي 25 ± 2 ° C تي 12 ڪلاڪ روشني/12 ڪلاڪ اونداهي چڪر هيٺ 5 ڏينهن تائين انڪيوبيٽ ڪيو ويو ته جيئن اسڪليروٽيا ٺهڻ کي تيز ڪري سگهجي. مٽي شامل ڪرڻ کان اڳ سڀني فلاسڪس جي مواد کي چڱي طرح ملايو ويو ته جيئن هڪجهڙائي کي يقيني بڻائي سگهجي. پوءِ، هر ٿانو ۾ 100 گرام ڪولونائيزنگ بران مرکب شامل ڪيو ويو ته جيئن پيٿوجنز جي مسلسل ڪنسنٽريشن کي يقيني بڻائي سگهجي. ٽيڪا لڳل ٿانو کي فنگل جي واڌ کي چالو ڪرڻ لاءِ پاڻي ڏنو ويو ۽ 7 ڏينهن لاءِ گرين هائوس حالتن ۾ رکيو ويو.
پوءِ هر ٿانو ۾ گيزا 3 قسم جا پنج ٻج پوکيا ويا. L-ornithine ۽ فنگسائيڊ Rizolex-T سان علاج ڪيل ٿانوَ لاءِ، جراثيم کان پاڪ ٻج کي پهريان ٻن مرکبن جي آبي محلول ۾ ٻن ڪلاڪن لاءِ ٻوڙيو ويو جنهن جي آخري IC99 ڪنسنٽريشن تقريبن 250 mg/L ۽ 50 mg/L هئي، ۽ پوءِ پوکڻ کان اڳ هڪ ڪلاڪ لاءِ هوا ۾ خشڪ ڪيو ويو. ٻئي طرف، ٻج کي منفي ڪنٽرول جي طور تي جراثيم کان پاڪ ڊسٽلڊ پاڻي ۾ ٻوڙيو ويو. 10 ڏينهن کان پوءِ، پهرين پاڻي ڏيڻ کان اڳ، ٻج کي ٿلهو ڪيو ويو، هر ٿانو ۾ صرف ٻه صاف ٻج بچيا. اضافي طور تي، S. sclerotiorum سان انفيڪشن کي يقيني بڻائڻ لاءِ، ساڳئي ترقي واري مرحلي (10 ڏينهن) تي لوبيا جي ٻوٽي جي پاڙن کي جراثيم کان پاڪ اسڪيلپل استعمال ڪندي ٻن مختلف هنڌن تي ڪٽيو ويو ۽ تقريبن 0.5 گرام ڪولونائيزنگ بران مرکب هر زخم ۾ رکيو ويو، جنهن کان پوءِ سڀني ٽيڪا لڳل ٻوٽن ۾ انفيڪشن ۽ بيماري جي ترقي کي تيز ڪرڻ لاءِ وڌيڪ نمي ڏني وئي. ڪنٽرول پلانٽس کي به ساڳئي طرح زخمي ڪيو ويو ۽ هڪ جيتري مقدار (0.5 گرام) جراثيم کان پاڪ، غير آباد ٿيل بران مرکب زخم ۾ رکيو ويو ۽ تيز نمي هيٺ رکيو ويو ته جيئن بيماري جي ترقي لاءِ ماحول کي نقل ڪري سگهجي ۽ علاج گروپن جي وچ ۾ تسلسل کي يقيني بڻائي سگهجي.
علاج جو طريقو: مٽيءَ کي سيراب ڪندي، لوبيا جي ٻج کي 500 ملي ليٽر ايل-اورنيٿائن (250 ملي گرام/ليٽر) يا فنگسائيڊ ريزوليڪس-ٽي (50 ملي گرام/ليٽر) جي آبي محلول سان پاڻي ڏنو ويو، پوءِ علاج 10 ڏينهن جي وقفي سان ٽي ڀيرا ورجايو ويو. پليسبو سان علاج ٿيل ڪنٽرولن کي 500 ملي ليٽر جراثيم کان پاڪ ڊسٽل پاڻي سان سيراب ڪيو ويو. سڀئي علاج گرين هائوس حالتن ۾ ڪيا ويا (25 ± 2 ° سي، 75 ± 1٪ نسبتي نمي، ۽ 8 ڪلاڪ روشني / 16 ڪلاڪ اونداهي جو فوٽو پيريڊ). سڀني ٿانون کي هر هفتي پاڻي ڏنو ويو ۽ هر مهيني هڪ متوازن NPK ڀاڻ (20-20-20، 3.6٪ سلفر ۽ TE مائڪرو ايليمينٽس سان؛ زين سيڊز، مصر) سان علاج ڪيو ويو، مخصوص قسم جي سفارشن ۽ ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق 3-4 گرام/ليٽر جي ڪنسنٽريشن تي فوليئر اسپرينگ ذريعي. جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو هجي، مڪمل طور تي وڌايل پختو پن (مٿي کان ٻيو ۽ ٽيون پن) هر حياتياتي نقل مان 72 ڪلاڪن جي پوسٽ-ٽريٽمينٽ (hpt) تي گڏ ڪيا ويا، هڪجهڙائي ڪئي وئي، گڏ ڪئي وئي ۽ -80 °C تي وڌيڪ تجزين لاءِ ذخيرو ڪئي وئي، جنهن ۾ آڪسائيڊيوٽ اسٽريس اشارن جي ان سيٽو هسٽو ڪيميڪل لوڪلائيزيشن، لپڊ پيرو آڪسائيڊيشن، اينزيميٽڪ ۽ غير اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽس ۽ جين ايڪسپريشن شامل آهن، پر ان تائين محدود نه آهن.
سفيد ڦڦڙن جي انفيڪشن جي شدت جو جائزو هفتيوار 21 ڏينهن پوسٽ انوڪيوليشن (dpi) ۾ پيٽزولڊٽ ۽ ڊڪسن اسڪيل (1996) جي بنياد تي ڪيو ويو، جيڪو ٽيران ۽ ٻين (2006) پاران تبديل ڪيو ويو هو. مختصر طور تي، بين ٻوٽن جي تنن ۽ شاخن جو جائزو انوڪيوليشن جي نقطي کان شروع ڪندي انوڪيوليشن جي نقطي تي ڪيو ويو ته جيئن انوڪيوليشن جي مرحلي کي انٽرينڊوز ۽ نوڊس سان گڏ ڪيو وڃي. انوڪيوليشن جي نقطي کان اسٽيم يا شاخ سان گڏ سڀ کان پري واري نقطي تائين زخم جو فاصلو پوءِ ماپيو ويو ۽ زخم جي جڳهه جي بنياد تي 1-9 جو اسڪور مقرر ڪيو ويو، جتي (1) انوڪيوليشن جي نقطي جي ويجهو ڪو به نظر نه ايندڙ انفيڪشن ظاهر ڪيو ۽ (2-9) نوڊس/انٽرينڊوز سان گڏ ڪيو ويو زخم جي سائيز ۽ ترقي ۾ بتدريج واڌ جو اشارو ڏنو (ضمني جدول S2). پوءِ فارمولا 2 استعمال ڪندي سفيد ڦڦڙن جي انفيڪشن جي شدت کي فيصد ۾ تبديل ڪيو ويو:
ان کان علاوه، بيماري جي ترقي واري وکر (AUDPC) جي هيٺان علائقي جو حساب فارمولا (شينر ۽ فني، 1977) استعمال ڪندي ڪيو ويو، جيڪو تازو عام لوبيا جي اڇي سڙي (چوهان ۽ ٻيا، 2020) لاءِ مساوات 3 استعمال ڪندي ترتيب ڏنو ويو هو:
جتي Yi = بيماري جي شدت وقت تي ti، Yi+1 = ايندڙ وقت تي بيماري جي شدت ti+1، ti = پهرين ماپ جو وقت (ڏينهن ۾)، ti+1 = ايندڙ ماپ جو وقت (ڏينهن ۾)، n = وقت جي نقطن يا مشاهدي جي نقطن جو ڪل تعداد. سڀني حياتياتي نقلن ۾ ٻوٽي جي اوچائي (سينٽي ميٽر)، هر ٻوٽي جي شاخن جو تعداد، ۽ هر ٻوٽي جي پنن جو تعداد سميت بين جي ٻوٽي جي واڌ جي پيرا ميٽرز هفتيوار 21 ڏينهن تائين رڪارڊ ڪيا ويا.
هر حياتياتي نقل ۾، پنن جا نمونا (مٿي کان ٻئي ۽ ٽئين مڪمل طور تي ترقي يافته پن) علاج کان پوءِ 45 هين ڏينهن تي گڏ ڪيا ويا (آخري علاج کان 15 ڏينهن پوءِ). هر حياتياتي نقل ۾ پنج ٿانو (هر ٿانو ۾ ٻه ٻوٽا) شامل هئا. تقريباً 500 ملي گرام ڪٽيل ٽشو فوٽوسنٿيٽڪ رنگن (ڪلوروفيل اي، ڪلوروفيل بي ۽ ڪيروٽينائيڊ) کي ڪڍڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو 80٪ ايسٽون کي اونداهي ۾ 4 °C تي استعمال ڪندي. 24 ڪلاڪن کان پوءِ، نمونن کي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ سپرنيٽينٽ کي ڪلوريفيل اي، ڪلوروفيل بي ۽ ڪيروٽينائيڊ مواد جي تعين لاءِ گڏ ڪيو ويو رنگين ميٽرڪ طور تي UV-160A اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيماڊزو ڪارپوريشن، جاپان) جي طريقي مطابق (لچٽينٿيلر، 1987) جي طريقي مطابق ٽن مختلف طول موج (A470، A646 ۽ A663 nm) تي جذب کي ماپڻ سان. آخرڪار، فوٽوسنٿيٽڪ رنگن جي مواد جو حساب هيٺ ڏنل فارمولا 4-6 استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو لچٽينٿيلر (1987) پاران بيان ڪيو ويو آهي.
72 ڪلاڪن جي پوسٽ-ٽريٽمينٽ (hpt) تي، پنن (مٿي کان ٻئي ۽ ٽئين مڪمل طور تي ترقي يافته پنن) کي هر حياتياتي نقل مان هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ (H2O2) ۽ سپر آڪسائيڊ اينين ​​(O2•−) جي ان سيٽو هسٽو ڪيميڪل لوڪلائيزيشن لاءِ گڏ ڪيو ويو. هر حياتياتي نقل ۾ پنج ٿانو (هر ٿانو ۾ ٻه ٻوٽا) شامل هئا. هر حياتياتي نقل کي نقل ۾ تجزيو ڪيو ويو (ٻه ٽيڪنيڪل نقل) طريقي جي درستگي، اعتبار ۽ پيداوار کي يقيني بڻائڻ لاءِ. H2O2 ۽ O2•− کي ترتيب وار 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) يا nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو، روميرو-پورٽاس ۽ ٻين (2004) ۽ آدم ۽ ٻين (1989) پاران بيان ڪيل طريقن تي عمل ڪندي معمولي تبديلين سان. H2O2 جي هسٽو ڪيميڪل لوڪلائيزيشن لاءِ، ليفليٽس کي 0.1% DAB سان 10 mM ٽريس بفر (pH 7.8) ۾ ويڪيوم ڪيو ويو ۽ پوءِ ڪمري جي حرارت تي روشني ۾ 60 منٽن لاءِ انڪيوب ڪيو ويو. ليفليٽس کي 0.15% (v/v) TCA ۾ 4:1 (v/v) ايٿانول: ڪلوروفارم (ال-گومھوريا دواسازي ۽ طبي سامان، قاهره، مصر) ۾ بليچ ڪيو ويو ۽ پوءِ روشني جي سامهون آندو ويو جيستائين اهي ڪارو نه ٿين. ساڳئي طرح، والوز کي 10 mM پوٽاشيم فاسفيٽ بفر (pH 7.8) سان ويڪيوم ڪيو ويو جنهن ۾ 0.1 w/v % HBT شامل هو ته جيئن O2•− ان سيٽو جي هسٽو ڪيميڪل لوڪلائيزيشن ڪئي وڃي. ليفليٽس کي ڪمري جي حرارت تي 20 منٽن لاءِ روشني ۾ انڪيوب ڪيو ويو، پوءِ مٿي ڏنل طرح بليچ ڪيو ويو، ۽ پوءِ روشن ڪيو ويو جيستائين ڳاڙهو نيرو/وايوليٽ اسپاٽ ظاهر نه ٿيا. نتيجي ۾ نڪرندڙ ڀوري (H2O2 اشاري جي طور تي) يا نيرو-وايوليٽ (O2•− اشاري جي طور تي) رنگ جي شدت جو جائزو تصوير پروسيسنگ پيڪيج ImageJ (http://fiji.sc; رسائي 7 مارچ 2024) جي فجي ورزن استعمال ڪندي ڪيو ويو.
مالونڊيالڊيهائيڊ (ايم ڊي اي؛ لپڊ پيرو آڪسائيڊيشن جي نشان جي طور تي) کي ڊو ۽ برامليج (1992) جي طريقي مطابق معمولي تبديلين سان طئي ڪيو ويو. هر حياتياتي نقل (مٿي کان ٻئي ۽ ٽئين مڪمل طور تي ترقي يافته پنن) مان پنن کي علاج کان پوءِ 72 ڪلاڪن (hpt) ۾ گڏ ڪيو ويو. هر حياتياتي نقل ۾ پنج ٿانو (هر ٿانو ۾ ٻه ٻوٽا) شامل هئا. هر حياتياتي نقل کي نقل ۾ تجزيو ڪيو ويو (ٻه ٽيڪنيڪل نقل) طريقي جي درستگي، اعتبار ۽ پيداوار کي يقيني بڻائڻ لاءِ. مختصر طور تي، 0.5 گرام زميني پتي جي ٽشو کي ايم ڊي اي ڪڍڻ لاءِ 20٪ ٽرائڪلورواسيٽڪ ايسڊ (TCA؛ ميلي پور سگما، برلنگٽن، ايم اي، آمريڪا) سان استعمال ڪيو ويو جنهن ۾ 0.01٪ بائيٽيلڊ هائيڊروڪسيٽولوئن (BHT؛ سگما-الڊرچ، سينٽ لوئس، ايم اي، آمريڪا) شامل هئا. پوءِ سپرنيٽينٽ ۾ MDA مواد کي UV-160A اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيماڊزو ڪارپوريشن، جاپان) استعمال ڪندي 532 ۽ 600 nm تي جذب کي ماپڻ سان رنگي ميٽرڪ طور تي طئي ڪيو ويو ۽ پوءِ nmol g−1 FW جي طور تي ظاهر ڪيو ويو.
غير اينزيميٽڪ ۽ اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽس جي تشخيص لاءِ، هر حياتياتي نقل مان پنن (مٿي کان ٻئي ۽ ٽئين مڪمل طور تي ترقي يافته پنن) کي 72 ڪلاڪن جي علاج کان پوءِ (hpt) تي گڏ ڪيو ويو. هر حياتياتي نقل ۾ پنج ٿانو (هر ٿانو ۾ ٻه ٻوٽا) شامل هئا. هر حياتياتي نموني جو تجزيو نقل ۾ ڪيو ويو (ٻه ٽيڪنيڪل نمونا). ٻن پنن کي مائع نائٽروجن سان پيس ڪيو ويو ۽ اينزيميٽڪ ۽ غير اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽس، ڪل امينو ايسڊ، پرولين مواد، جين اظهار، ۽ آڪسيليٽ مقدار جي تعين لاءِ سڌو سنئون استعمال ڪيو ويو.
ڪُل حل ٿيندڙ فينولڪس کي فولين-سيوڪلٽيو ري ايجنٽ (سگما-الڊرچ، سينٽ لوئس، ايم او، آمريڪا) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو، جنهن کي ڪاهڪونن ۽ ٻين (1999) پاران بيان ڪيل طريقي ۾ ٿوري تبديلي سان. مختصر طور تي، تقريبن 0.1 گرام هم جنس پتي جي ٽشو کي 20 ملي ليٽر 80٪ ميٿانول سان 24 ڪلاڪن لاءِ اونداهي ۾ ڪڍيو ويو ۽ سينٽرفيوگيشن کان پوءِ سپرنيٽينٽ گڏ ڪيو ويو. نموني جي 0.1 ملي ليٽر کي 0.5 ملي ليٽر فولين-سيوڪلٽيو ري ايجنٽ (10٪) سان ملايو ويو، 30 سيڪنڊن لاءِ هلايو ويو ۽ 5 منٽن لاءِ اونداهي ۾ ڇڏيو ويو. پوءِ 0.5 ملي ليٽر 20٪ سوڊيم ڪاربونيٽ محلول (Na2CO3؛ ال-گومھوريا دواسازي ۽ طبي سامان ڪمپني، قاهره، مصر) هر ٽيوب ۾ شامل ڪيو ويو، چڱي طرح ملايو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي اونداهي ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. انڪيوبيشن کان پوءِ، رد عمل جي مرکب جي جذب کي UV-160A اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيماڊزو ڪارپوريشن، جاپان) استعمال ڪندي 765 nm تي ماپيو ويو. نموني جي عرق ۾ ڪل حل ٿيندڙ فينول جي ڪنسنٽريشن کي گيلڪ ايسڊ ڪيليبريشن وکر (فشر سائنٽيفڪ، هيمپٽن، NH، USA) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو ۽ تازو وزن جي في گرام (mg GAE g-1 تازو وزن) گيلڪ ايسڊ جي برابر مليگرام جي طور تي ظاهر ڪيو ويو.
ڪُل حل ٿيندڙ فليونوائيڊ مواد کي جيريڊين ۽ ٻين (2006) جي طريقي مطابق معمولي تبديلين سان طئي ڪيو ويو. مختصر طور تي، مٿي ڏنل ميٿانول ڪڍڻ جي 0.3 ملي ليٽر کي 0.3 ملي ليٽر 5٪ ايلومينيم ڪلورائڊ محلول (AlCl3؛ فشر سائنٽيفڪ، هيمپٽن، NH، USA) سان ملايو ويو، زور سان ملايو ويو ۽ پوءِ ڪمري جي حرارت تي 5 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ان کان پوءِ 0.3 ملي ليٽر 10٪ پوٽاشيم ايسٽيٽ محلول (ال-گومھوريا دواسازي ۽ طبي سامان، قاهره، مصر) شامل ڪيو ويو، چڱي طرح ملايو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي 30 منٽن لاءِ اونداهي ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. انڪيوبيشن کان پوءِ، رد عمل جي مرکب جي جذب کي UV-160A اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيمازو ڪارپوريشن، جاپان) استعمال ڪندي 430 nm تي ماپيو ويو. نموني جي عرق ۾ ڪُل حل ٿيندڙ فليونوائيڊس جي ڪنسنٽريشن کي رتن ڪيليبريشن وکر (TCI آمريڪا، پورٽلينڊ، OR، USA) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو ۽ پوءِ تازو وزن جي في گرام (mg RE g-1 تازو وزن) جي برابر رتن جي مليگرام جي طور تي ظاهر ڪيو ويو.
لوبيا جي پنن جي ڪل مفت امينو ايسڊ مواد جو تعين هڪ تبديل ٿيل نائن هائيڊرين ري ايجنٽ (ٿرمو سائنٽيفڪ ڪيميڪلز، والٿم، ايم اي، آمريڪا) استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو يوڪوياما ۽ هيراماتسو (2003) پاران تجويز ڪيل ۽ سن ايٽ ال (2006) پاران تبديل ڪيل طريقي جي بنياد تي ڪيو ويو. مختصر طور تي، 0.1 گرام زميني ٽشو کي پي ايڇ 5.4 بفر سان ڪڍيو ويو، ۽ سپرنيٽنٽ جي 200 μL کي 200 μL نائن هائيڊرين (2٪) ۽ 200 μL پائريڊائن (10٪؛ اسپيڪٽرم ڪيميڪل، نيو برنسوڪ، اين جي، آمريڪا) سان رد عمل ڪيو ويو، 30 منٽن لاءِ اُبلندڙ پاڻي جي غسل ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، پوءِ ٿڌو ڪيو ويو ۽ UV-160A اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيماڊزو ڪارپوريشن، جاپان) استعمال ڪندي 580 nm تي ماپيو ويو. ٻئي طرف، پرولين کي بيٽس جي طريقي سان طئي ڪيو ويو (بيٽس ايٽ ال، 1973). پرولين کي 3٪ سلفوسالائسلڪ ايسڊ (ٿرمو سائنٽيفڪ ڪيميڪلز، والٿم، ايم اي، يو ايس اي) سان ڪڍيو ويو ۽ سينٽرفيوگيشن کان پوءِ، 0.5 ملي ليٽر سپرنيٽينٽ کي 1 ملي ليٽر گليشيل ايسٽڪ ايسڊ (فشر سائنٽيفڪ، هيمپٽن، اين ايڇ، يو ايس اي) ۽ نائن هائيڊرين ري ايجنٽ سان ملايو ويو، 90 ° سي تي 45 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، مٿي ڏنل ساڳئي اسپيڪٽرو فوٽوميٽر استعمال ڪندي 520 nm تي ٿڌو ۽ ماپيو ويو. پنن جي عرق ۾ ڪل مفت امينو ايسڊ ۽ پرولين ترتيب وار گلائسين ۽ پرولين ڪيليبريشن وکر (سگما-الڊرچ، سينٽ لوئس، ايم اي، يو ايس اي) استعمال ڪندي طئي ڪيا ويا، ۽ mg/g تازي وزن جي طور تي ظاهر ڪيا ويا.
اينٽي آڪسيڊنٽ اينزائمز جي اينزيميٽڪ سرگرمي کي طئي ڪرڻ لاءِ، تقريبن 500 ملي گرام هم جنس ٽشو ڪڍيو ويو 3 ملي ليٽر 50 ملي ميٽر ٽريس بفر (pH 7.8) سان جنهن ۾ 1 ملي ميٽر EDTA-Na2 (سگما-الڊرچ، سينٽ لوئس، MO، USA) ۽ 7.5٪ پولي ونائلپائرولڊون (PVP؛ سگما-الڊرچ، سينٽ لوئس، MO، USA) شامل هئا، 10,000 × g تي 20 منٽن لاءِ ريفريجريشن (4 °C) هيٺ سينٽريفيوج ڪيو ويو، ۽ سپرنيٽينٽ (خام اينزائم ايڪسٽريڪٽ) گڏ ڪيو ويو (ايل-نگار ۽ ٻيا، 2023؛ عثمان ۽ ٻيا، 2023). پوءِ Catalase (CAT) کي 0.1 M سوڊيم فاسفيٽ بفر جي 2 ml (pH 6.5؛ Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) ۽ 100 μl 269 mM H2O2 محلول سان رد عمل ڪيو ويو ته جيئن ان جي اينزيميٽڪ سرگرمي کي Aebi (1984) جي طريقي مطابق معمولي تبديلين سان طئي ڪيو وڃي (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiacol-dependent peroxidase (POX) اينزيميٽڪ سرگرمي Harrach et al. (2009) جي طريقي سان طئي ڪئي وئي. (2008) معمولي تبديلين سان (ايل-نگار ۽ ٻيا، 2023؛ عثمان ۽ ٻيا، 2023) ۽ پولي فينول آڪسائيڊس (پي پي او) جي اينزيميٽڪ سرگرمي 2.2 ملي ليٽر 100 ايم ايم سوڊيم فاسفيٽ بفر (پي ايڇ 6.0)، 100 μl گائيڪول (ٽي سي آءِ ڪيميڪلز، پورٽلينڊ، او آر، آمريڪا) ۽ 100 μl 12 ايم ايم H2O2 سان رد عمل کان پوءِ طئي ڪئي وئي. طريقو ٿورو تبديل ڪيو ويو (ايل-نگار ۽ ٻيا، 2023؛ عثمان ۽ ٻيا، 2023) کان. ٽيسٽ 3 ملي ليٽر ڪيٽيڪول محلول (ٿرمو سائنٽيفڪ ڪيميڪلز، والٿم، ايم اي، آمريڪا) (0.01 ايم) سان رد عمل کان پوءِ ڪيو ويو جيڪو تازو 0.1 ايم فاسفيٽ بفر (پي ايڇ 6.0) ۾ تيار ڪيو ويو. CAT سرگرمي کي 240 nm (A240) تي H2O2 جي خراب ٿيڻ جي نگراني ڪندي ماپيو ويو، POX سرگرمي کي 436 nm (A436) تي جذب ۾ واڌ جي نگراني ڪندي ماپيو ويو، ۽ PPO سرگرمي کي UV-160A اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيماڊزو، جاپان) استعمال ڪندي هر 30 سيڪنڊن لاءِ 495 nm (A495) تي جذب جي اتار چڙهاؤ کي رڪارڊ ڪندي ماپيو ويو.
ريئل ٽائيم RT-PCR ٽن اينٽي آڪسيڊنٽ سان لاڳاپيل جينز جي ٽرانسڪرپٽ ليول کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، جن ۾ پيروڪسسومل ڪيٽيليس (PvCAT1؛ جين بينڪ ايڪسيشن نمبر KF033307.1)، سپر آڪسائيڊ ڊسموٽيس (PvSOD؛ جين بينڪ ايڪسيشن نمبر XM_068639556.1)، ۽ گلوٽاٿيون ريڊڪٽيس (PvGR؛ جين بينڪ ايڪسيشن نمبر KY195009.1) شامل آهن، آخري علاج کان 72 ڪلاڪ پوءِ لوبيا جي پنن ۾ (مٿي کان ٻئي ۽ ٽئين مڪمل طور تي ترقي يافته پنن). مختصر طور تي، ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول مطابق Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1؛ BioFlux، Biori Technology، China) استعمال ڪندي RNA کي الڳ ڪيو ويو. پوءِ، ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق CDNA کي TOP script™ cDNA Synthesis Kit استعمال ڪندي سنٿيسس ڪيو ويو. مٿي ڏنل ٽن جينز جا پرائمر سيڪوئنس ضمني جدول S3 ۾ درج ٿيل آهن. PvActin-3 (GenBank Accession number: XM_068616709.1) کي گھر جي سنڀال جين طور استعمال ڪيو ويو ۽ لاڳاپيل جين اظهار کي 2-ΔΔCT طريقو استعمال ڪندي ڳڻيو ويو (Livak ۽ Schmittgen، 2001). حياتياتي دٻاءُ (عام ڀاڄين ۽ اينٿراڪنوز فنگس ڪوليٽوٽريچم لنڊيموٿينم جي وچ ۾ غير مطابقت رکندڙ رابطي) ۽ ابياتي دٻاءُ (خشڪ، لوڻ، گهٽ درجه حرارت) هيٺ ايڪٽين جي استحڪام جو مظاهرو ڪيو ويو (Borges et al.، 2012).
اسان شروعاتي طور تي ايس اسڪليروٽيوريم ۾ آڪسالواسيٽيٽ ايسٽيل هائيڊروليز (OAH) پروٽين جو جينوم وائڊ ان سليڪو تجزيو پروٽين-پروٽين BLAST ٽول (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) استعمال ڪندي ڪيو. مختصر طور تي، اسان ايسپرگلس فيجينسس سي بي ايس 313.89 (AfOAH; ٽيڪسائيڊ: 1191702; جين بينڪ ايڪسيشن نمبر XP_040799428.1; 342 امينو ايسڊ) ۽ پينسيليم ليگينا (PlOAH; ٽيڪسائيڊ: 94218; جين بينڪ ايڪسيشن نمبر XP_056833920.1; 316 امينو ايسڊ) مان ايس اسڪليروٽيوريم (ٽيڪسائيڊ: 5180) ۾ هوموگلوس پروٽين کي نقشي ۾ آڻڻ لاءِ سوال جي تسلسل طور OAH استعمال ڪيو. BLASTp نيشنل سينٽر فار بايو ٽيڪنالاجي انفارميشن (NCBI) ويب سائيٽ، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ تي GenBank ۾ تازي طور تي موجود S. sclerotiorum جينوم ڊيٽا جي خلاف ڪيو ويو.
ان کان علاوه، ايس. اسڪليروٽيوريم (SsOAH) مان پيشنگوئي ڪيل OAH جين ۽ A. fijiensis CBS 313.89 ۽ P. lagena مان PlOAH جي ارتقائي تجزيي ۽ فائلوجينيٽڪ وڻ کي MEGA11 (Tamura et al., 2021) ۽ JTT ميٽرڪس تي ٻڌل ماڊل (Jones et al., 1992) ۾ وڌ کان وڌ امڪان جي طريقي سان اندازو لڳايو ويو. فائلوجينيٽڪ وڻ کي ايس. اسڪليروٽيوريم مان سڀني پيشنگوئي ڪيل OAH جينز (SsOAH) جي پروٽين جي ترتيبن جي گھڻن ترتيبن جي تجزيي ۽ ڪنسٽرنٽ بيسڊ الائنمينٽ ٽول (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ۽ Agarwala، 2007) استعمال ڪندي سوال جي ترتيب سان گڏ ڪيو ويو. ان کان علاوه، ايس. اسڪليروٽيوريم مان ايس او اي اي ايڇ جي بهترين ملندڙ امينو ايسڊ تسلسل کي ڪلسٽل ڊبليو (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) استعمال ڪندي ڪوري تسلسل (AfOAH ۽ PlOAH) (Larkin et al., 2007) سان ترتيب ڏنو ويو، ۽ ترتيب ۾ محفوظ علائقن کي ESPript ٽول (ورژن 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) استعمال ڪندي تصور ڪيو ويو.
وڌيڪ، S. sclerotiorum SsOAH جي اڳڪٿي ڪيل فنڪشنل نمائندگي ڊومينز ۽ محفوظ ڪيل سائيٽن کي انٽرپرو ٽول (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (بلم ۽ ٻيا، 2021) استعمال ڪندي مختلف خاندانن ۾ انٽرايڪٽو طور تي درجه بندي ڪيو ويو. آخرڪار، اڳڪٿي ڪيل S. sclerotiorum SsOAH جي ٽي-dimensional (3D) structure ماڊلنگ پروٽين هومولوجي/اينالاگ ريڪگنيشن انجن (Phyre2 سرور ورزن 2.0؛ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (ڪيلي ۽ ٻيا، 2015) استعمال ڪندي ڪئي وئي ۽ SWISS-MODEL سرور (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini ۽ ٻيا، 2014) استعمال ڪندي تصديق ڪئي وئي. اڳڪٿي ڪيل ٽي-dimensional structures (PDB فارميٽ) کي UCSF-Chimera پيڪيج (ورزن 1.15؛ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004) استعمال ڪندي انٽرايڪٽو طور تي تصور ڪيو ويو.
مقداري ريئل ٽائيم فلوروسينس پي سي آر کي اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم جي مائيسيليا ۾ آڪسالواسيٽيٽ ايسٽيل هائيڊروليز (SsOAH؛ جين بينڪ ايڪسيشن نمبر: XM_001590428.1) جي ٽرانسڪرپشنل ليول کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. مختصر طور تي، ايس. اسڪليروٽيوريم کي پي ڊي بي تي مشتمل هڪ فلاسڪ ۾ انڪوليٽ ڪيو ويو ۽ هڪ لرزندڙ انڪيوبيٽر (ماڊل: I2400، نيو برنسوڪ سائنٽيفڪ ڪمپني، ايڊيسن، اين جي، يو ايس اي) ۾ 25 ± 2 °C تي 150 rpm تي 24 ڪلاڪن لاءِ ۽ مسلسل اونداهي ۾ (24 ڪلاڪ) مائيسيليا جي واڌ کي تيز ڪرڻ لاءِ رکيو ويو. ان کان پوءِ، سيلز کي آخري IC50 ڪنسنٽريشن (تقريبن 40 ۽ 3.2 ملي گرام/ليٽر، ترتيب وار) تي L-ornithine ۽ فنگسائيڊ ريزوليڪس-ٽي سان علاج ڪيو ويو ۽ پوءِ ساڳئي حالتن ۾ ٻئي 24 ڪلاڪن لاءِ ڪلچر ڪيو ويو. انڪيوبيشن کان پوءِ، ڪلچرن کي 5 منٽن لاءِ 2500 rpm تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ سپرنيٽينٽ (فنگل مائيسيليم) کي جين ايڪسپريشن تجزيي لاءِ گڏ ڪيو ويو. ساڳئي طرح، فنگل مائيسيليم کي 0، 24، 48، 72، 96، ۽ 120 ڪلاڪ پوسٽ انفڪشن تي متاثر ٿيل ٻوٽن مان گڏ ڪيو ويو جيڪي متاثر ٿيل ٽشوز جي مٿاڇري تي اڇو مولڊ ۽ ڪپهه جي مائيسيليم ٺاهيندا هئا. آر اين اي فنگل مائيسيليم مان ڪڍيو ويو ۽ پوءِ مٿي بيان ڪيل سي ڊي اين اي کي سنٿيسائيز ڪيو ويو. SsOAH لاءِ پرائمر سيڪوئنس ضمني جدول S3 ۾ درج ٿيل آهن. SsActin (GenBank Accession نمبر: XM_001589919.1) کي گھر جي سنڀال جين طور استعمال ڪيو ويو، ۽ لاڳاپيل جين ايڪسپريشن کي 2-ΔΔΔCT طريقو استعمال ڪندي حساب ڪيو ويو (Livak ۽ Schmittgen، 2001).
آڪسالڪ ايسڊ کي آلو ڊيڪسٽروس برٿ (PDB) ۽ ٻوٽن جي نمونن ۾ طئي ڪيو ويو جنهن ۾ فنگل پيٿوجن اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم شامل هو، زو ۽ ژانگ (2000) جي طريقي مطابق ٿوري تبديلين سان. مختصر طور تي، ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽس کي PDB تي مشتمل فلاسڪس ۾ انڪوليٽ ڪيو ويو ۽ پوءِ هڪ لرزندڙ انڪيوبيٽر (ماڊل I2400، نيو برنسوڪ سائنٽيفڪ ڪمپني، ايڊيسن، NJ، USA) ۾ 150 rpm تي 25 ± 2 °C تي 3-5 ڏينهن لاءِ مسلسل اونداهي ۾ (24 ڪلاڪ) ڪلچر ڪيو ويو ته جيئن مائيسيليم جي واڌ کي تيز ڪيو وڃي. انڪيوبيشن کان پوءِ، فنگل ڪلچر کي پهريان واٽمن #1 فلٽر پيپر ذريعي فلٽر ڪيو ويو ۽ پوءِ 5 منٽن لاءِ 2500 rpm تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ته جيئن باقي مائيسيليم کي هٽايو وڃي. سپرنيٽينٽ کي 4°C تي گڏ ڪيو ويو ۽ آڪسليٽ جي وڌيڪ مقداري تعين لاءِ ذخيرو ڪيو ويو. ٻوٽن جي نمونن جي تياري لاءِ، تقريبن 0.1 گرام ٻوٽي جي ٽشو جا ٽڪرا ٽي ڀيرا ڊسٽل پاڻي (هر ڀيري 2 ملي ليٽر) سان ڪڍيا ويا. پوءِ نمونن کي 5 منٽن لاءِ 2500 rpm تي سينٽرفيوج ڪيو ويو، سپرنيٽنٽ کي واٽمن نمبر 1 فلٽر پيپر ذريعي خشڪ فلٽر ڪيو ويو ۽ وڌيڪ تجزيي لاءِ گڏ ڪيو ويو.
آڪسالڪ ايسڊ جي مقداري تجزيي لاءِ، رد عمل جو مرکب هڪ شيشي جي اسٽاپ ٿيل ٽيوب ۾ هيٺ ڏنل ترتيب ۾ تيار ڪيو ويو: 0.2 ملي ليٽر نمونو (يا پي ڊي بي ڪلچر فلٽريٽ يا آڪسالڪ ايسڊ معياري حل)، 0.11 ملي ليٽر بروموفينول نيرو (بي پي بي، 1 ايم ايم؛ فشر ڪيميڪل، پٽسبرگ، پي اي، آمريڪا)، 0.198 ملي ليٽر 1 ايم سلفورڪ ايسڊ (H2SO4؛ ال-گومھوريا دواسازي ۽ طبي سامان، قاهره، مصر) ۽ 0.176 ملي ليٽر 100 ايم ايم پوٽاشيم ڊائڪروميٽ (K2Cr2O7؛ ٽي سي آءِ ڪيميڪل، پورٽلينڊ، او آر، آمريڪا)، ۽ پوءِ محلول کي ڊسٽلڊ پاڻي سان 4.8 ملي ليٽر تائين ملائي ڇڏيو ويو، زور سان ملايو ويو ۽ فوري طور تي 60 °C پاڻي جي غسل ۾ رکيو ويو. 10 منٽن کان پوءِ، رد عمل کي 0.5 ملي ليٽر سوڊيم هائيڊروڪسائيڊ محلول (NaOH؛ 0.75 ايم) شامل ڪندي روڪيو ويو. رد عمل جي مرکب جي جذب (A600) کي UV-160 اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (شيماڊزو ڪارپوريشن، جاپان) استعمال ڪندي 600 nm تي ماپيو ويو. ڪلچر فلٽريٽس ۽ ٻوٽن جي نمونن جي مقدار جي ڪنٽرول لاءِ ترتيب وار PDB ۽ ڊسٽلڊ پاڻي استعمال ڪيا ويا. ڪلچر فلٽريٽس ۾ آڪسالڪ ايسڊ ڪنسنٽريشن، PDB ميڊيم (μg.mL−1) جي في ملي ليٽر آڪسالڪ ايسڊ جي مائڪروگرام جي طور تي ظاهر ڪيو ويو، ۽ پنن جي عرق ۾، تازو وزن جي في گرام آڪسالڪ ايسڊ جي مائڪروگرام جي طور تي ظاهر ڪيو ويو (μg.g−1 FW)، هڪ آڪسالڪ ايسڊ ڪيليبريشن وکر (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ ڪيميڪلز، والٿم، ايم اي، آمريڪا) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو.
مطالعي دوران، سڀئي تجربا مڪمل طور تي بي ترتيب ڊيزائن (CRD) ۾ ٺهيل هئا، هر علاج لاءِ ڇهه حياتياتي نقل ۽ هر حياتياتي نقل لاءِ پنج برتن (هر برتن لاءِ ٻه ٻوٽا) جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو هجي. حياتياتي نقلن جو تجزيو نقل ۾ ڪيو ويو (ٻه ٽيڪنيڪل نقل). ٽيڪنيڪل نقلن کي ساڳئي تجربي جي پيداوار جي قابليت کي جانچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو پر جعلي نقلن کان بچڻ لاءِ شمارياتي تجزيي ۾ استعمال نه ڪيو ويو. ڊيٽا کي ويرينس جي تجزيي (ANOVA) استعمال ڪندي شمارياتي طور تي تجزيو ڪيو ويو جنهن کان پوءِ ٽوڪي-ڪرمر ايمانداري سان اهم فرق (HSD) ٽيسٽ (p ≤ 0.05). ان ويٽرو تجربن لاءِ، IC50 ۽ IC99 قدرن کي پروبٽ ماڊل استعمال ڪندي ڳڻيو ويو ۽ 95٪ اعتماد جي وقفن جو حساب ڪيو ويو.
مصر جي الغابيه گورنريٽ ۾ مختلف سويابين جي ميدانن مان ڪل چار آئسوليٽس گڏ ڪيا ويا. پي ڊي اي ميڊيم تي، سڀني آئسوليٽس ڪريمي اڇو مائيسيليم پيدا ڪيو جيڪو جلدي ڪپهه جو اڇو ٿي ويو (شڪل 1A) ۽ پوءِ اسڪليروٽيم اسٽيج تي بيج يا ناسي. اسڪليروٽيا عام طور تي گهاٽا، ڪارا، گول يا بي ترتيب شڪل جا هوندا آهن، 5.2 کان 7.7 ملي ميٽر ڊگھا ۽ 3.4 کان 5.3 ملي ميٽر قطر ۾ (شڪل 1B). جيتوڻيڪ چار آئسوليٽس 25 ± 2 °C تي 10-12 ڏينهن جي انڪيوبيشن کان پوءِ ڪلچر ميڊيم جي ڪناري تي اسڪليروٽيا جو هڪ حاشيي نمونو تيار ڪيو (شڪل 1A)، في پليٽ اسڪليروٽيا جو تعداد انهن ۾ خاص طور تي مختلف هو (P < 0.001)، آئسوليٽس 3 ۾ اسڪليروٽيا جو سڀ کان وڌيڪ تعداد هو (32.33 ± 1.53 اسڪليروٽيا في پليٽ؛ شڪل 1C). ساڳئي طرح، آئسوليٽ #3 ٻين آئسوليٽس جي ڀيٽ ۾ PDB ۾ وڌيڪ آڪسالڪ ايسڊ پيدا ڪيو (3.33 ± 0.49 μg.mL−1؛ شڪل 1D). آئسوليٽ #3 فائٽوپيٿوجينڪ فنگس اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم جي عام مورفولوجيڪل ۽ خوردبيني خاصيتون ڏيکاريون. مثال طور، PDA تي، آئسوليٽ #3 جون ڪالونيون تيزي سان وڌيون، ڪريمي اڇيون هيون (شڪل 1A)، ريورس بيج يا هلڪو سامن پيلو-ڀورو، ۽ 9 سينٽي ميٽر قطر واري پليٽ جي مٿاڇري کي مڪمل طور تي ڍڪڻ لاءِ 25 ± 2°C تي 6-7 ڏينهن جي ضرورت هئي. مٿي ڏنل مورفولوجيڪل ۽ خوردبيني خاصيتن جي بنياد تي، آئسوليٽ #3 کي اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم طور سڃاتو ويو.
شڪل 1. عام ڀاڄين جي فصلن مان ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽس جون خاصيتون ۽ بيماري. (الف) پي ڊي اي ميڊيم تي چار ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽس جي مائيسيلي واڌ، (ب) چار ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽس جي اسڪليروٽيا، (سي) اسڪليروٽيريا جو تعداد (في پليٽ)، (ڊي) پي ڊي بي ميڊيم تي آڪسالڪ ايسڊ سيڪريشن (μg.mL−1)، ۽ (اي) گرين هائوس حالتن ۾ حساس ڪمرشل ڀاڄين جي ڪلٽيور گيزا 3 تي چار ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽس جي بيماري جي شدت (%). قدر پنج حياتياتي نقلن جي اوسط ± SD جي نمائندگي ڪن ٿا (n = 5). مختلف اکر علاج جي وچ ۾ شمارياتي طور تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (p < 0.05). (F–H) عام اڇي مولڊ جون علامتون ترتيب وار زمين جي تنن ۽ سليڪ تي ظاهر ٿيون، آئسوليٽ #3 (dpi) سان 10 ڏينهن بعد انوڪيوليشن. (I) ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽ #3 جي اندروني ٽرانسڪرائب ٿيل اسپيسر (ITS) علائقي جو ارتقائي تجزيو وڌ ۾ وڌ امڪان جي طريقي سان ڪيو ويو ۽ نيشنل سينٽر فار بايو ٽيڪنالاجي انفارميشن (NCBI) ڊيٽابيس (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) مان حاصل ڪيل 20 ريفرنس آئسوليٽس/اسٽين سان مقابلو ڪيو ويو. ڪلسٽرنگ لائينن جي مٿان انگ علائقي جي ڪوريج (%) کي ظاهر ڪن ٿا، ۽ ڪلسٽرنگ لائينن جي هيٺان انگ شاخ جي ڊيگهه کي ظاهر ڪن ٿا.
وڌيڪ، بيماري جي تصديق ڪرڻ لاءِ، چار حاصل ڪيل ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽس کي گرين هائوس حالتن ۾ حساس ڪمرشل بين ڪلٽيوار گيزا 3 کي ٽيڪوليٽ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، جيڪو ڪوچ جي پوسٽوليٽس (شڪل 1E) سان مطابقت رکي ٿو. جيتوڻيڪ سڀئي حاصل ڪيل فنگل آئسوليٽس پيٿوجينڪ هئا ۽ سائي بين (cv. Giza 3) کي متاثر ڪري سگهن ٿا، جنهن جي ڪري زمين جي سڀني حصن (شڪل 1F) تي عام سفيد مولڊ جون علامتون پيدا ٿيون، خاص طور تي تنن (شڪل 1G) ۽ پوڊس (شڪل 1H) تي 10 ڏينهن جي انوڪيوليشن (dpi) تي، آئسوليٽ 3 ٻن آزاد تجربن ۾ سڀ کان وڌيڪ جارحتي آئسوليٽ هو. آئسوليٽ 3 ۾ بين جي ٻوٽن تي سڀ کان وڌيڪ بيماري جي شدت (%) هئي (24.0 ± 4.0، 58.0 ± 2.0، ۽ 76.7 ± 3.1 تي 7، 14، ۽ 21 ڏينهن جي انفيڪشن کان پوءِ، ترتيب وار؛ شڪل 1F).
سڀ کان وڌيڪ ناگوار ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽ #3 جي سڃاڻپ اندروني ٽرانسڪرائبڊ اسپيسر (ITS) سيڪوئنسنگ (شڪل 1I) جي بنياد تي وڌيڪ تصديق ڪئي وئي. آئسوليٽ #3 ۽ 20 ريفرنس آئسوليٽس/اسٽينز جي وچ ۾ فائيولوجينيٽڪ تجزيو انهن جي وچ ۾ اعليٰ مماثلت (>99%) ڏيکاري. اهو قابل ذڪر آهي ته ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽ #3 (533 bp) ۾ خشڪ مٽر جي ٻج مان الڳ ٿيل آمريڪي ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽ LPM36 (GenBank Accession نمبر MK896659.1؛ 540 bp) ۽ چيني ايس. اسڪليروٽيوريم آئسوليٽ YKY211 (GenBank Accession نمبر OR206374.1؛ 548 bp) سان هڪ اعليٰ مماثلت آهي، جيڪو وائلٽ (Matthiola incana) اسٽيم روٽ جو سبب بڻجندو آهي، جيڪي سڀئي ڊينڊروگرام جي چوٽي تي الڳ الڳ گروپ ڪيا ويا آهن (شڪل 1I). نئين ترتيب کي NCBI ڊيٽابيس ۾ جمع ڪيو ويو آهي ۽ ان جو نالو "Sclerotinia sclerotiorum - isolate YN-25" (GenBank accession number PV202792) رکيو ويو آهي. اهو ڏسي سگهجي ٿو ته isolate 3 سڀ کان وڌيڪ ناگوار isolate آهي؛ تنهن ڪري، هن isolate کي ايندڙ سڀني تجربن ۾ مطالعي لاءِ چونڊيو ويو.
مختلف ڪنسنٽريشنز (12.5، 25، 50، 75، 100 ۽ 125 mg/L) تي S. sclerotiorum isolate 3 جي خلاف diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich، Darmstadt، جرمني) جي اينٽي بيڪٽيريل سرگرمي جي جاچ ان ويٽرو ۾ ڪئي وئي. اهو قابل ذڪر آهي ته L-ornithine هڪ اينٽي بيڪٽيريل اثر ڪيو ۽ بتدريج S. sclerotiorum hyphae جي ريڊيل واڌ کي دوز تي منحصر انداز ۾ روڪيو (شڪل 2A، B). سڀ کان وڌيڪ ڪنسنٽريشن ٽيسٽ ٿيل (125 mg/L) تي، L-ornithine سڀ کان وڌيڪ مائيسيليئل واڌ جي روڪٿام جي شرح (99.62 ± 0.27٪؛ شڪل 2B) جو مظاهرو ڪيو، جيڪو ڪمرشل فنگسائيڊ Rizolex-T (روڪٿام جي شرح 99.45 ± 0.39٪؛ شڪل 2C) جي برابر هو سڀ کان وڌيڪ ڪنسنٽريشن ٽيسٽ ٿيل (10 mg/L) تي، ساڳئي اثرائتي کي ظاهر ڪري ٿو.
شڪل 2. Sclerotinia sclerotiorum جي خلاف L-ornithine جي ان ويٽرو اينٽي بيڪٽيريل سرگرمي. (الف) S. sclerotiorum جي خلاف L-ornithine جي مختلف ڪنسنٽريشنز جي اينٽي بيڪٽيريل سرگرمي جو تجارتي فنگسائيڊ Rizolex-T (10 mg/L) سان مقابلو. (ب، سي) L-ornithine (12.5، 25، 50، 75، 100 ۽ 125 mg/L) يا Rizolex-T (2، 4، 6، 8 ۽ 10 mg/L) جي مختلف ڪنسنٽريشنز سان علاج کان پوءِ S. sclerotiorum mycelial واڌ جي روڪٿام جي شرح (%). قدر پنج حياتياتي نقلن جي اوسط ± SD جي نمائندگي ڪن ٿا (n = 5). مختلف اکر علاج جي وچ ۾ شمارياتي فرق کي ظاهر ڪن ٿا (p < 0.05). (ڊي، اي) L-ornithine ۽ تجارتي فنگسائيڊ Rizolex-T جو پروبٽ ماڊل ريگريشن تجزيو، ترتيب وار. پروبٽ ماڊل ريگريشن لائن هڪ مضبوط نيري لڪير جي طور تي ڏيکاريل آهي، ۽ اعتماد جو وقفو (95٪) هڪ ڊش ٿيل ڳاڙهي لڪير جي طور تي ڏيکاريل آهي.
ان کان علاوه، پروبٽ ريگريشن تجزيو ڪيو ويو ۽ لاڳاپيل پلاٽ ٽيبل 1 ۽ شڪل 2D،E ۾ ڏيکاريا ويا آهن. مختصر طور تي، L-ornithine جي قابل قبول سلپ ويليو (y ​​= 2.92x − 4.67) ۽ لاڳاپيل اهم انگ اکر (Cox & Snell R2 = 0.3709، Nagelkerke R2 = 0.4998 ۽ p < 0.0001؛ شڪل 2D) تجارتي فنگسائيڊ Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99، Cox & Snell R2 = 0.1242، Nagelkerke R2 = 0.1708 ۽ p < 0.0001) (ٽيبل 1) جي مقابلي ۾ S. sclerotiorum جي خلاف هڪ بهتر اينٽي فنگل سرگرمي جي نشاندهي ڪئي.
جدول 1. ايس. اسڪليروٽيوريم جي خلاف L-ornithine ۽ ڪمرشل فنگسائيڊ "Rizolex-T" جي اڌ وڌ ۾ وڌ روڪڻ واري ڪنسنٽريشن (IC50) ۽ IC99 (mg/l) جا قدر.
مجموعي طور تي، L-ornithine (250 mg/L) علاج نه ڪيل S. sclerotiorum-متاثر ٿيل ٻوٽن جي مقابلي ۾ علاج ٿيل عام لوبيا جي ٻوٽن تي اڇي ڦڦڙ جي ترقي ۽ شدت کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو (ڪنٽرول؛ شڪل 3A). مختصر طور تي، جيتوڻيڪ علاج نه ٿيل متاثر ٿيل ڪنٽرول ٻوٽن جي بيماري جي شدت بتدريج وڌي وئي (52.67 ± 1.53، 83.21 ± 2.61، ۽ 92.33 ± 3.06٪)، L-ornithine سڄي تجربي دوران بيماري جي شدت (%) کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو (8.97 ± 0.15، 18.00 ± 1.00، ۽ 26.36 ± 3.07) 7، 14، ۽ 21 ڏينهن پوسٽ-ٽريٽمينٽ (dpt) تي، ترتيب وار (شڪل 3A). ساڳئي طرح، جڏهن ايس. اسڪليروٽيوريم کان متاثر ٿيل لوبيا جي ٻوٽن کي 250 ملي گرام/ليٽر ايل-اورنيٿائن سان علاج ڪيو ويو، ته بيماري جي واڌ ويجهه واري وکر (AUDPC) هيٺان علائقو علاج نه ٿيل ڪنٽرول ۾ 1274.33 ± 33.13 کان گهٽجي 281.03 ± 7.95 ٿي ويو، جيڪو مثبت ڪنٽرول 50 ملي گرام/ليٽر ريزوليڪس-ٽي فنگسائيڊ (183.61 ± 7.71؛ شڪل 3B) کان ٿورو گهٽ هو. ٻئي تجربي ۾ به ساڳيو رجحان ڏٺو ويو.
شڪل 3. گرين هائوس حالتن ۾ اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم جي ڪري عام لوبيا جي اڇي سڙي جي ترقي تي L-ornithine جي خارجي استعمال جو اثر. (الف) 250 mg/L L-ornithine سان علاج کان پوءِ عام لوبيا جي اڇي مولڊ جي بيماري جي ترقي جو وکر. (ب) L-ornithine سان علاج کان پوءِ عام لوبيا جي اڇي مولڊ جي بيماري جي ترقي جي وکر (AUDPC) هيٺان علائقو. قدر پنج حياتياتي نقلن جي اوسط ± SD جي نمائندگي ڪن ٿا (n = 5). مختلف اکر علاج جي وچ ۾ شمارياتي طور تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (p < 0.05).
250 mg/L L-ornithine جي خارجي استعمال سان 42 ڏينهن کان پوءِ ٻوٽي جي اوچائي بتدريج وڌي وئي (شڪل 4A)، هر ٻوٽي جي شاخن جو تعداد (شڪل 4B)، ۽ هر ٻوٽي جي پنن جو تعداد (شڪل 4C). جڏهن ته ڪمرشل فنگسائيڊ Rizolex-T (50 mg/L) جو مطالعي ڪيل سڀني غذائي معيارن تي سڀ کان وڏو اثر پيو، 250 mg/L L-ornithine جي خارجي استعمال جو علاج نه ٿيل ڪنٽرولن جي مقابلي ۾ ٻيو وڏو اثر پيو (شڪل 4A-C). ٻئي طرف، ايل-اورنيٿائن جي علاج جو فوٽوسنٿيٽڪ رنگن ڪلوروفيل a (شڪل 4D) ۽ ڪلوروفيل b (شڪل 4E) جي مواد تي ڪو خاص اثر نه پيو، پر منفي ڪنٽرول (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) ۽ مثبت ڪنٽرول (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt؛ شڪل 4F) جي مقابلي ۾ ڪل ڪيروٽينائيڊ مواد (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) ۾ ٿورو اضافو ٿيو. مجموعي طور تي، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ايل-اورنيٿائن علاج ٿيل ٻجن لاءِ فائٽوٽوڪسڪ نه آهي ۽ شايد انهن جي واڌ کي به متحرڪ ڪري سگهي ٿي.
شڪل 4. گرين هائوس حالتن ۾ اسڪليروٽينيا اسڪليروٽيوريم سان متاثر ٿيل لوبيا جي پنن جي واڌ جي خاصيتن ۽ فوٽوسنٿيٽڪ رنگن تي خارجي ايل-اورنيٿائن جي استعمال جو اثر. (الف) ٻوٽي جي اوچائي (سينٽي ميٽر)، (ب) هر ٻوٽي جي شاخن جو تعداد، (سي) هر ٻوٽي جي پنن جو تعداد، (ڊي) ڪلوروفيل a مواد (mg g-1 fr wt)، (اي) ڪلوروفيل b مواد (mg g-1 fr wt)، (ايف) ڪل ڪيروٽينائيڊ مواد (mg g-1 fr wt). قدر پنج حياتياتي نقلن جي اوسط ± SD آهن (n = 5). مختلف اکر علاج جي وچ ۾ شمارياتي طور تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (p < 0.05).
رد عمل واري آڪسيجن جي نسلن (ROS؛ هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ [H2O2] جي طور تي ظاهر ڪيل) ۽ آزاد ريڊيڪلز (سپر آڪسائيڊ اينائنز [O2•−] جي طور تي ظاهر ڪيل) جي ان سيٽو هسٽو ڪيميڪل لوڪلائيزيشن ظاهر ڪيو ته L-ornithine (250 mg/L) جي خارجي استعمال H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW؛ شڪل 5A) ۽ O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW؛ شڪل 5B) جي جمع کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو، ٻنهي علاج نه ٿيل متاثر ٿيل ٻوٽن (173.31 ± 12.06 ۽ 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW، ترتيب وار) ۽ ٻوٽن جي 50 mg/L سان علاج ٿيل تجارتي فنگسائيڊ Rizolex-T (170.12 ± 9.50 ۽ 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr) جي مقابلي ۾. (ترتيب وار wt) 72 ڪلاڪن تي. hpt (شڪل 5A، B) جي تحت H2O2 ۽ O2•− جي اعليٰ سطح گڏ ڪئي وئي. ساڳئي طرح، TCA تي ٻڌل مالونڊيالڊيهائيڊ (MDA) جي جاچ ڏيکاري ٿي ته S. sclerotiorum-متاثر ٿيل لوبيا جي ٻوٽن پنهنجي پنن ۾ MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) جي اعليٰ سطح گڏ ڪئي (شڪل 5C). جڏهن ته، L-ornithine جي خارجي استعمال لپڊ پيرو آڪسائيڊشن کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو جيئن علاج ٿيل ٻوٽن ۾ MDA مواد ۾ گهٽتائي (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) جي ثبوت سان.
شڪل 5. گرين هائوس حالتن ۾ انفيڪشن کان پوءِ 72 ڪلاڪن تي ايس. اسڪليروٽيوريم سان متاثر ٿيل لوبيا جي پنن ۾ آڪسائيڊيوٽ اسٽريس ۽ غير اينزيميٽڪ اينٽي آڪسيڊنٽ دفاعي ميڪانيزم جي مکيه نشانن تي خارجي ايل-اورنيٿائن جي استعمال جو اثر. (الف) هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt تي، (ب) سپر آڪسائيڊ اينيون (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt تي، (سي) مالونڊيالڊيهائيڊ (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt تي، (ڊي) ڪل حل ٿيندڙ فينول (mg GAE g−1 FW) 72 hpt تي، (اي) ڪل حل ٿيندڙ فليونوائيڊ (mg RE g−1 FW) 72 hpt تي، (ايف) ڪل مفت امينو ايسڊ (mg g−1 FW) 72 hpt تي، ۽ (جي) پرولين مواد (mg g−1 FW) 72 hpt تي. قدر 5 حياتياتي نقلن جي اوسط ± معياري انحراف (مطلب ± SD) جي نمائندگي ڪن ٿا (n = 5). مختلف اکر علاج جي وچ ۾ شمارياتي طور تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (p < 0.05).