Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جي استعمال ڪيل برائوزر جي ورزن ۾ محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين نتيجن لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان پنهنجي برائوزر جو نئون ورزن استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). ساڳئي وقت، جاري سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائلنگ يا جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ ڏيکاري رهيا آهيون.
پروپيونڪ ايسڊ (PPA) آٽزم اسپيڪٽرم ڊس آرڊر جهڙن نيورو ڊولپمينٽل خرابين ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي ڪردار جو مطالعو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. PPA مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس، ميٽابولزم، ۽ ٽرن اوور کي خراب ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو. تنهن هوندي به، انهن ميڪانيزم جي پيچيده وقتي نوعيت جي ڪري مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس، فيشن ۽ فيوزن تي PPA جا اثر مسئلا بڻيل آهن. هتي، اسان مڪمل مقداري اميجنگ ٽيڪنڪ استعمال ڪندا آهيون ته ڪيئن PPA نيورون جهڙي SH-SY5Y سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل الٽرا اسٽرڪچر، مورفولوجي، ۽ ڊائنامڪس کي متاثر ڪري ٿو. PPA (5 mM) مائيٽوڪونڊريل علائقي (p < 0.01)، فيريٽ قطر ۽ گهيرو (p < 0.05)، ۽ علائقي 2 (p < 0.01) ۾ اهم گهٽتائي جو سبب بڻيو. مائيٽوڪونڊريل ايونٽ لوڪيٽر تجزيو فيشن ۽ فيوزن واقعن ۾ هڪ اهم واڌارو (p < 0.05) ڏيکاريو، انهي ڪري دٻاءُ جي حالتن ۾ مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ جي سالميت کي برقرار رکيو. ان کان علاوه، cMYC (p < 0.0001)، NRF1 (p < 0.01)، TFAM (p < 0.05)، STOML2 (p < 0.0001) ۽ OPA1 (p < 0.05) جي mRNA اظهار کي خاص طور تي گهٽايو ويو. 01). هي دٻاءُ جي حالتن ۾ ڪم کي برقرار رکڻ لاءِ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي، بايوجينيسس ۽ ڊائنامڪس جي ريموڊلنگ کي واضح ڪري ٿو. اسان جو ڊيٽا مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس تي PPA جي اثرن ۾ نئين بصيرت فراهم ڪري ٿو ۽ مائيٽوڪونڊريل اسٽريس جوابن ۾ شامل پيچيده ريگيوليٽري ميڪانيزم جي مطالعي لاءِ اميجنگ ٽيڪنڪ جي افاديت کي اجاگر ڪري ٿو.
مائٽوڪونڊريا توانائي جي پيداوار ۽ بايو سنٿيسس ۾ پنهنجي عام ڪردار کان ٻاهر مختلف سيلولر ڪمن ۾ لازمي حصو وٺندڙ آهن. مائٽوڪونڊريل ميٽابولزم ڪلسيم سگنلنگ، ميٽابولڪ ۽ ريڊوڪس هوميوسٽاسس، سوزش سگنلنگ، ايپي جينيٽڪ تبديلين، سيل جي واڌ، تفريق ۽ پروگرام ٿيل سيل جي موت جو هڪ اهم ريگيوليٽر آهي. خاص طور تي، مائٽوڪونڊريل ميٽابولزم نيورونل ترقي، بقا ۽ ڪم لاءِ اهم آهي ۽ نيوروپيٿولوجي 2,3,4 جي مختلف اظهارن ۾ وڏي پيماني تي ملوث آهي.
گذريل ڏهاڪي دوران، ميٽابولڪ حيثيت نيوروجينيسس، تفريق، پختگي ۽ پلاسٽيسٽي جي مرڪزي ريگيوليٽر جي طور تي ابھري آهي 5,6. تازو، مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ ڊائنامڪس خاص طور تي مائٽوسس جا اهم جزا بڻجي ويا آهن، هڪ متحرڪ عمل جيڪو سيلز اندر صحتمند مائيٽوڪونڊريا جي تلاءَ کي برقرار رکي ٿو. مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس پيچيده باهمي انحصار ڪندڙ رستن ذريعي منظم ڪيا ويندا آهن جيڪي مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس ۽ بايو اينرجيٽڪس کان وٺي مائيٽوڪونڊريل فيشن، فيوزن، ٽرانسپورٽ ۽ ڪليئرنس 7,8 تائين آهن. انهن مان ڪنهن به انٽيگريٽو ميڪانيزم جي خلل صحتمند مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ جي سار سنڀال کي متاثر ڪري ٿو ۽ نيوروڊولپمينٽ لاءِ گہرا فنڪشنل نتيجا آهن 9,10. حقيقت ۾، مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جي خرابي ڪيترن ئي نفسياتي، نيوروڊجينيريٽري ۽ نيوروڊولپمينٽل خرابين ۾ ڏٺي ويندي آهي، جنهن ۾ آٽزم اسپيڪٽرم ڊس آرڊر (ASD) 11,12 شامل آهن.
ASD هڪ پيچيده جينياتي ۽ ايپي جينيٽڪ آرڪيٽيڪچر سان گڏ هڪ متضاد نيورو ڊولپمينٽل خرابي آهي. ASD جي ورثي ۾ ڪو شڪ ناهي، پر بنيادي ماليڪيولر ايٽولوجي اڃا تائين خراب طور تي سمجهي وئي آهي. پري ڪلينڪل ماڊلز، ڪلينڪل مطالعي، ۽ ملٽي اومڪس ماليڪيولر ڊيٽاسيٽس مان ڊيٽا گڏ ڪرڻ ASD13,14 ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جو وڌندڙ ثبوت فراهم ڪري ٿو. اسان اڳ ۾ ASD سان مريضن جي هڪ گروپ ۾ هڪ جينوم-وائڊ ڊي اين اي ميٿيليشن اسڪرين ڪئي ۽ مائيٽوڪونڊريل ميٽابولڪ رستن 15 سان گڏ ڪلسٽر ٿيل مختلف ميٿيل ٿيل جين جي سڃاڻپ ڪئي. اسان بعد ۾ مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس ۽ ڊائنامڪس جي مرڪزي ريگيوليٽرز جي ڊفرنشل ميٿيليشن جي رپورٽ ڪئي، جيڪا ASD16 ۾ وڌندڙ mtDNA ڪاپي نمبر ۽ تبديل ٿيل پيشاب جي ميٽابولڪ پروفائل سان لاڳاپيل هئي. اسان جو ڊيٽا وڌندڙ ثبوت فراهم ڪري ٿو ته مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۽ هوميوسٽاسس ASD جي پيٿوفزيولوجي ۾ مرڪزي ڪردار ادا ڪن ٿا. تنهن ڪري، مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس، مورفولوجي، ۽ فنڪشن جي وچ ۾ تعلق جي ميڪانياتي سمجھ کي بهتر بڻائڻ ثانوي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي خاصيت واري اعصابي بيمارين ۾ جاري تحقيق جو هڪ اهم مقصد آهي.
مائيٽوڪونڊريل دٻاءُ جي جوابن ۾ مخصوص جينز جي ڪردار جو مطالعو ڪرڻ لاءِ ماليڪيولر ٽيڪنڪ اڪثر استعمال ڪيون وينديون آهن. بهرحال، هي طريقو مائيٽوٽڪ ڪنٽرول ميڪانيزم جي گهڻ رخي ۽ وقتي نوعيت جي ڪري محدود ٿي سگهي ٿو. ان کان علاوه، مائيٽوڪونڊريل جينز جو فرق وارو اظهار فنڪشنل تبديلين جو هڪ اڻ سڌي اشارو آهي، خاص طور تي جڏهن ته صرف محدود تعداد ۾ جينز جو تجزيو ڪيو ويندو آهي. تنهن ڪري، مائيٽوڪونڊريل فنڪشن ۽ بايو اينرجيٽڪس جي مطالعي لاءِ وڌيڪ سڌي طريقا تجويز ڪيا ويا آهن17. مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس سان ويجهي سان لاڳاپيل آهي. مائيٽوڪونڊريل شڪل، ڪنيڪٽوٽي، ۽ ڍانچي توانائي جي پيداوار ۽ مائيٽوڪونڊريل ۽ سيل جي بقا لاءِ اهم آهن5,18. ان کان علاوه، مائيٽوسس جا مختلف جزا مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۾ تبديلين تي ڌيان ڏين ٿا، جيڪي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي مفيد آخري نقطي طور ڪم ڪري سگهن ٿا ۽ بعد ۾ ميڪانياتي مطالعي لاءِ بنياد فراهم ڪن ٿا.
ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپي (TEM) استعمال ڪندي مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي جو سڌو سنئون مشاهدو ڪري سگهجي ٿو، جيڪو سيلولر الٽرا اسٽرڪچر جي تفصيلي مطالعي جي اجازت ڏئي ٿو. TEM سيل آبادي ۾ صرف جين ٽرانسڪرپشن، پروٽين ايڪسپريشن يا مائيٽوڪونڊريل فنڪشنل پيرا ميٽرز تي ڀروسو ڪرڻ جي بدران، انفرادي مائيٽوڪونڊريل ڪرسٽي جي مورفولوجي، شڪل ۽ ساخت کي سڌو سنئون تصور ڪري ٿو17,19,20. ان کان علاوه، TEM مائيٽوڪونڊريا ۽ ٻين آرگنيلز جي وچ ۾ رابطي جي مطالعي کي آسان بڻائي ٿو، جهڙوڪ اينڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم ۽ آٽوفاگوسومس، جيڪي مائيٽوڪونڊريل فنڪشن ۽ هوميوسٽاسس ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا21,22. اهڙيءَ طرح، اهو TEM کي مخصوص رستن يا جينز تي ڌيان ڏيڻ کان اڳ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي مطالعي لاءِ هڪ سٺو شروعاتي نقطو بڻائي ٿو. جيئن ته مائيٽوڪونڊريل فنڪشن نيوروپيٿولوجي سان وڌيڪ لاڳاپيل ٿيندو وڃي ٿو، ان ويٽرو نيورونل ماڊلز ۾ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ ڊائنامڪس جو سڌو سنئون ۽ مقداري طور تي مطالعو ڪرڻ جي قابل هجڻ جي واضح ضرورت آهي.
هن آرٽيڪل ۾، اسان آٽزم اسپيڪٽرم ڊس آرڊر ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي نيورونل ماڊل ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جو جائزو وٺون ٿا. اسان اڳ ۾ ASD15 ۾ پروپيونيل-CoA ڪاربوڪسيلس بيٽا (PCCB) جي ڊفرنشل ميٿيليشن جي رپورٽ ڪئي، جيڪو مائيٽوڪونڊريل پروپيونيل-CoA ڪاربوڪسيلس اينزائم پي سي سي جو هڪ سب يونٽ آهي. پي سي سي جي خرابي پروپيونيل ڊيريويٽيوز جي زهريلي جمع ٿيڻ جو سبب بڻجندي آهي، جنهن ۾ پروپيونيل ايسڊ (PPA)23,24,25 شامل آهن. PPA کي نيورونل ميٽابولزم کي خراب ڪرڻ ۽ وييو ۾ رويي کي تبديل ڪرڻ لاءِ ڏيکاريو ويو آهي ۽ ASD26,27,28 ۾ شامل نيورو ڊولپمينٽل ميڪانيزم جي مطالعي لاءِ هڪ قائم ٿيل جانورن جو ماڊل آهي. اضافي طور تي، PPA کي ويٽرو ۾ مائيٽوڪونڊريل جھلي جي صلاحيت، بايوجينيسس ۽ تنفس کي خراب ڪرڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي ۽ نيورونز ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن کي ماڊل ڪرڻ لاءِ وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويو آهي 29,30. بهرحال، مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ ڊائنامڪس تي PPA-حوصلہ افزائي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جو اثر خراب طور تي سمجهي ويو آهي.
هي مطالعو SH-SY5Y سيلز ۾ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي، ڊائنامڪس، ۽ فنڪشن تي PPA جي اثرن کي مقدار ڏيڻ لاءِ مڪمل تصويري ٽيڪنڪ استعمال ڪري ٿو. پهرين، اسان مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ الٽرا اسٽرڪچر ۾ تبديلين کي ڏسڻ لاءِ هڪ TEM طريقو تيار ڪيو 17,31,32. مائيٽوڪونڊريل 33 جي متحرڪ نوعيت کي ڏنو، اسان PPA دٻاءُ هيٺ فيشن ۽ فيوزن واقعن، مائڪروٽونڊريل نمبر ۽ حجم جي وچ ۾ توازن ۾ تبديلين کي مقدار ڏيڻ لاءِ مائيٽوڪونڊريل ايونٽ لوڪلائيزر (MEL) تجزيو پڻ استعمال ڪيو. آخرڪار، اسان جانچ ڪئي ته ڇا مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ ڊائنامڪس بايوجينيسس، فيشن، ۽ فيوزن ۾ شامل جين جي اظهار ۾ تبديلين سان لاڳاپيل آهن. گڏ ڪري، اسان جو ڊيٽا مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس کي منظم ڪرڻ واري ميڪانيزم جي پيچيدگي کي واضح ڪرڻ جي چئلينج کي واضح ڪري ٿو. اسان SH-SY5Y سيلز ۾ مائيٽوسس جي ماپيبل ڪنورجنٽ اينڊ پوائنٽ جي طور تي مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي جي مطالعي ۾ TEM جي افاديت کي اجاگر ڪريون ٿا. اضافي طور تي، اسان اجاگر ڪريون ٿا ته TEM ڊيٽا امير ترين معلومات فراهم ڪري ٿو جڏهن امیجنگ ٽيڪنڪ سان گڏ ڪيو وڃي ٿو جيڪي ميٽابولڪ دٻاءُ جي جواب ۾ متحرڪ واقعن کي پڻ پڪڙين ٿا. ماليڪيولر ريگيوليٽري ميڪانيزم جي وڌيڪ خاصيت جيڪي نيورونل سيل مائٽوسس جي حمايت ڪن ٿا، اعصابي نظام جي مائيٽوڪونڊريل جزو ۽ نيوروڊيجينريٽو بيمارين ۾ اهم بصيرت فراهم ڪري سگهن ٿيون.
مائيٽوڪونڊريل دٻاءُ پيدا ڪرڻ لاءِ، SH-SY5Y سيلز کي 3 ايم ايم ۽ 5 ايم ايم سوڊيم پروپيونيٽ (NaP) استعمال ڪندي پي پي اي سان علاج ڪيو ويو. ٽي اي ايم کان اڳ، نمونن کي هاءِ پريشر فريزنگ ۽ فريزنگ استعمال ڪندي ڪرائيوجينڪ نموني تيار ڪرڻ جي تابع ڪيو ويو (شڪل 1a). اسان ٽن حياتياتي نقلن ۾ مائيٽوڪونڊريل آبادي جي اٺ مورفولوجيڪل پيرا ميٽرز کي ماپڻ لاءِ هڪ خودڪار مائيٽوڪونڊريل تصويري تجزيو پائپ لائن تيار ڪئي. اسان ڏٺو ته پي پي اي علاج چار پيرا ميٽرز کي خاص طور تي تبديل ڪيو: ايريا 2، ايريا، پريميٽ، ۽ فيريٽ قطر (شڪل 1b-e). ايريا 2 ٻنهي 3 ايم ايم ۽ 5 ايم ايم پي پي اي علاج (p = 0.0183 ۽ p = 0.002، ترتيب وار) (شڪل 1b) سان خاص طور تي گهٽجي ويو، جڏهن ته ايريا (p = 0.003)، پريميٽ (p = 0.0106) ۽ فيريٽ قطر سڀ خاص طور تي گهٽجي ويا آهن. ڪنٽرول گروپ (شڪل 1c-e) جي مقابلي ۾ 5 ايم ايم علاج گروپ ۾ هڪ اهم گهٽتائي (p = 0.0172) هئي. علائقي ۽ گهيري ۾ اهم گهٽتائي ڏيکاري ٿي ته 5 ايم ايم پي پي اي سان علاج ڪيل سيلز ننڍا، وڌيڪ گول مائيٽوڪونڊريا هئا، ۽ اهي مائيٽوڪونڊريا ڪنٽرول سيلز جي ڀيٽ ۾ گهٽ ڊگھا هئا. اهو فيريٽ قطر ۾ هڪ اهم گهٽتائي سان پڻ مطابقت رکي ٿو، هڪ آزاد پيرا ميٽر جيڪو ذرڙن جي ڪنارن جي وچ ۾ سڀ کان وڏي فاصلي ۾ گهٽتائي کي ظاهر ڪري ٿو. ڪرسٽي جي الٽرا اسٽرڪچر ۾ تبديليون ڏٺيون ويون: ڪرسٽي پي پي اي دٻاءُ جي اثر هيٺ گهٽ واضح ٿي وئي (شڪل 1a، پينل بي). بهرحال، سڀئي تصويرون واضح طور تي ڪرسٽي جي الٽرا اسٽرڪچر کي ظاهر نه ٿيون ڪن، تنهن ڪري انهن تبديلين جو مقداري تجزيو نه ڪيو ويو. اهي ٽي اي ايم ڊيٽا ٽن ممڪن منظرنامي کي ظاهر ڪري سگهن ٿا: (1) پي پي اي فيشن کي وڌائي ٿو يا فيوزن کي روڪي ٿو، جنهن جي ڪري موجوده مائيٽوڪونڊريا سائيز ۾ گهٽجي ٿو؛ (2) وڌايل بايوجينيسس نئون، ننڍو مائيٽوڪونڊريا پيدا ڪري ٿو يا (3) ٻنهي ميڪانيزم کي هڪ ئي وقت متاثر ڪري ٿو. جيتوڻيڪ انهن حالتن کي ٽي اي ايم پاران فرق نه ٿو ڪري سگهجي، اهم مورفولوجيڪل تبديليون پي پي اي دٻاءُ جي تحت مائيٽوڪونڊريا هوميوسٽاسس ۽ ڊائنامڪس ۾ تبديلين جي نشاندهي ڪن ٿيون. اسان بعد ۾ انهن ڊائنامڪس ۽ انهن جي تحت امڪاني ميڪانيزم کي وڌيڪ نمايان ڪرڻ لاءِ اضافي پيرا ميٽرز جي ڳولا ڪئي.
پروپيونڪ ايسڊ (PPA) مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي کي ٻيهر ٺاهي ٿو. (a) نمائندي ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپي (TEM) تصويرون ڏيکارين ٿيون ته مائيٽوڪونڊريل سائيز گهٽجي ٿو ۽ مائيٽوڪونڊريل ننڍا ۽ وڌيڪ گول ٿي ويندا آهن PPA علاج وڌائڻ سان؛ 0 mM (غير علاج ٿيل)، 3 mM ۽ 5 mM، ترتيب وار. ڳاڙهي تير مائيٽوڪونڊريا کي ظاهر ڪن ٿا. (b–e) 24 ڪلاڪن لاءِ PPA سان علاج ڪيل SH-SY5Y سيلز TEM لاءِ تيار ڪيا ويا ۽ نتيجن جو تجزيو Fiji/ImageJ استعمال ڪندي ڪيو ويو. اٺن مان چار پيرا ميٽرز ڪنٽرول (غير علاج ٿيل، 0 mM PPA) ۽ علاج ٿيل (3 mM ۽ 5 mM PPA) سيلز جي وچ ۾ اهم فرق ڏيکاريا. (b) علائقو 2، (c) علائقو، (d) پريم، (e) فيريٽ قطر. ويريئنس جو هڪ طرفو تجزيو (ڪنٽرول بمقابله علاج) ۽ ڊنيٽ جي گھڻن مقابلي واري ٽيسٽ کي اهم فرقن کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو (p < 0.05). ڊيٽا پوائنٽ هر انفرادي سيل لاءِ سراسري مائيٽوڪونڊريل قدر جي نمائندگي ڪن ٿا، ۽ غلطي بار اوسط ± SEM جي نمائندگي ڪن ٿا. ڏيکاريل ڊيٽا n = 3 جي نمائندگي ڪري ٿو، گهٽ ۾ گهٽ 24 سيل في نقل؛ ڪل 266 تصويرن جو تجزيو ڪيو ويو؛ * p < 0.05 کي ظاهر ڪري ٿو، ** p < 0.01 کي ظاهر ڪري ٿو.
وڌيڪ وضاحت ڪرڻ لاءِ ته ڪيئن مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس پي پي اي کي جواب ڏين ٿا، اسان مائيٽوڪونڊريا کي ٽيٽرا ميٿيل روڊامائن ايٿائل ايسٽر (TMRE) سان رنگ ڏنو ۽ 3 ۽ 5 ايم ايم پي پي اي تي 24 ڪلاڪن کان پوءِ مائيٽوڪونڊريا کي مقامي ڪرڻ ۽ مقدار ڏيڻ لاءِ ٽائيم ليپس مائڪروسڪوپي ۽ MEL تجزيو استعمال ڪيو. فيشن ۽ فيوزن واقعن جو علاج. (شڪل 2a). MEL تجزيو کان پوءِ، مائيٽوڪونڊريا کي وڌيڪ تجزيو ڪيو ويو ته جيئن مائيٽوڪونڊريل ڍانچي جي تعداد ۽ انهن جي سراسري مقدار کي مقدار ڏئي سگهجي. اسان ڏٺو ته 3 ملي ميٽر [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] تي ٿيندڙ فيشن واقعن جي تعداد ۾ هڪ ننڍڙو پر اهم اضافو فيشن [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] ۽ فيوزن [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ۽ فيوزن [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] جي مقابلي ۾ ڪنٽرول (شڪل 3b) جي مقابلي ۾ 5 ملي ميٽر تي مائيٽوڪونڊريا جي تعداد ۾ خاص طور تي اضافو ٿيو. 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ۽ 5 ملي ميٽر [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (شڪل 3c) ٻنهي تي مائيٽوڪونڊريا جي تعداد ۾ خاص طور تي اضافو ٿيو، جڏهن ته هر مائيٽوڪونڊريل ڍانچي جو سراسري حجم تبديل نه ٿيو (شڪل 3c). 3d). گڏجي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جي ري ماڊلنگ هڪ معاوضي واري جواب جي طور تي ڪم ڪري ٿي جيڪا ڪاميابي سان مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ جي سالميت کي برقرار رکي ٿي. 3 ايم ايم پي پي اي تي فيشن واقعن جي تعداد ۾ اضافو اهو ظاهر ڪري ٿو ته مائيٽوڪونڊريل نمبر ۾ اضافو جزوي طور تي مائيٽوڪونڊريل فيشن جي ڪري آهي، پر اهو ڏنو ويو آهي ته سراسري مائيٽوڪونڊريل حجم بنيادي طور تي تبديل نه ٿيو آهي، بايوجينيسس کي اضافي معاوضي واري جواب جي طور تي رد نٿو ڪري سگهجي. بهرحال، اهي ڊيٽا TEM پاران مشاهدو ڪيل ننڍڙن، گول مائيٽوڪونڊريل structuresن سان مطابقت رکن ٿا ۽ PPA پاران متاثر ٿيندڙ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۾ اهم تبديليون پڻ ظاهر ڪن ٿا.
پروپيونڪ ايسڊ (PPA) نيٽ ورڪ جي سالميت کي برقرار رکڻ لاءِ متحرڪ مائيٽوڪونڊريل ريموڊلنگ کي متاثر ڪري ٿو. SH-SY5Y سيلز کي ڪلچر ڪيو ويو، 24 ڪلاڪن لاءِ 3 ۽ 5 mM PPA سان علاج ڪيو ويو ۽ TMRE ۽ Hoechst 33342 سان داغ ڏنو ويو جنهن کان پوءِ MEL تجزيو ڪيو ويو. (a) نمائندگي ڪندڙ ٽائيم ليپس مائڪروسڪوپي تصويرون جيڪي هر حالت لاءِ وقت 2 (t2) تي رنگ ۽ بائنرائزڊ وڌ ۾ وڌ شدت جي پروجئشن کي ظاهر ڪن ٿيون. هر بائنري تصوير ۾ ظاهر ڪيل چونڊيل علائقا بهتر ڪيا ويا آهن ۽ 3D ۾ ٽن مختلف وقت فريم (t1-t3) تي ڏيکاريا ويا آهن ته جيئن وقت سان گڏ حرڪت کي واضح ڪري سگهجي؛ فيوزن واقعا سائي رنگ ۾ نمايان ڪيا ويا آهن؛ فيشن واقعا سائي رنگ ۾ نمايان ڪيا ويا آهن. ڳاڙهي رنگ ۾ ڏيکاريل. (b) هر حالت ۾ متحرڪ واقعن جو سراسري تعداد. (c) هر سيل ۾ مائيٽوڪونڊريل ڍانچي جو سراسري تعداد. (d) هر سيل ۾ هر مائيٽوڪونڊريل ڍانچي جو سراسري حجم (µm3). ڏيکاريل ڊيٽا هر علاج گروپ ۾ n = 15 سيلز جي نمائندگي ڪري ٿو. ڏيکاريل غلطي بار اوسط ± SEM، اسڪيل بار = 10 μm، * p < 0.05 جي نمائندگي ڪن ٿا.
پروپيونڪ ايسڊ (PPA) مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس سان لاڳاپيل جينز جي ٽرانسڪرپشنل دٻاءُ جو سبب بڻجندو آهي. SH-SY5Y سيلز کي 24 ڪلاڪن لاءِ 3 ۽ 5 mM PPA سان علاج ڪيو ويو. RT-qPCR استعمال ڪندي لاڳاپيل جين مقدار کي انجام ڏنو ويو ۽ B2M تي نارمل ڪيو ويو. مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس جينز (a) cMYC، (b) TFAM، (c) NRF1 ۽ (d) NFE2L2. مائيٽوڪونڊريل فيوزن ۽ فيشن جينز (e) STOML2، (f) OPA1، (g) MFN1، (h) MFN2 ۽ (i) DRP1. اهم فرق (p < 0.05) کي ون-وے ANOVA (ڪنٽرول بمقابلہ علاج) ۽ ڊنيٽ جي گھڻن مقابلي واري ٽيسٽ استعمال ڪندي آزمايو ويو: * p < 0.05 کي ظاهر ڪري ٿو، ** p < 0.01 کي ظاهر ڪري ٿو، ۽ **** p < 0.0001 کي ظاهر ڪري ٿو. بار سراسري اظهار ± SEM جي نمائندگي ڪن ٿا. ڏيکاريل ڊيٽا n = 3 (STOML2، OPA1، TFAM)، n = 4 (cMYC، NRF1، NFE2L2)، ۽ n = 5 (MFN1، MFN2، DRP1) حياتياتي نقلن جي نمائندگي ڪري ٿو.
TEM ۽ MEL تجزين مان ڊيٽا گڏجي ظاهر ڪري ٿو ته PPA مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ ڊائنامڪس کي تبديل ڪري ٿو. بهرحال، اهي تصويري طريقا انهن عملن کي هلائڻ واري بنيادي ميڪانيزم ۾ بصيرت فراهم نٿا ڪن. تنهن ڪري اسان PPA علاج جي جواب ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس، بايوجينيسس، ۽ ميٽوسس جي نو اهم ريگيوليٽرن جي mRNA اظهار جو جائزو ورتو. اسان سيل ميلوما آنڪوجين (cMYC)، نيوڪليئر ريسپائريٽري فيڪٽر (NRF1)، مائيٽوڪونڊريل ٽرانسڪرپشن فيڪٽر 1 (TFAM)، NFE2 جهڙو ٽرانسڪرپشن فيڪٽر BZIP (NFE2L2)، گيسٽرن جهڙو پروٽين 2 (STOML2)، آپٽڪ نرو ايٽروفي 1 (OPA1)، مائيٽوفسين 1 (MFN1)، مائيٽوفسين 2 (MFN2) ۽ ڊائنامين سان لاڳاپيل پروٽين 1 (DRP1) کي 3 ايم ايم ۽ 5 ايم ايم پي پي اي سان 24 ڪلاڪن جي علاج کان پوءِ مقدار ۾ طئي ڪيو. اسان 3 ايم ايم (p = 0.0053، p = 0.0415 ۽ p < 0.0001، ترتيب وار) ۽ 5 ايم ايم (p = 0.0031، p = 0.0233، p < 0.0001) پي پي اي علاج جو مشاهدو ڪيو. (شڪل 3a–c). ايم آر اين اي اظهار ۾ گهٽتائي خوراک تي منحصر هئي: سي ايم وائي سي، اين آر ايف 1 ۽ ٽي ايف اي ايم جو اظهار 3 ايم ايم تي ترتيب وار 5.7، 2.6 ۽ 1.9 ڀيرا گهٽجي ويو، ۽ 5 ايم ايم تي 11.2، 3 ۽ 2.2 ڀيرا گهٽجي ويو. ان جي ابتڙ، مرڪزي ريڊوڪس بايوجينيسس جين NFE2L2 کي پي پي اي جي ڪنهن به ڪنسنٽريشن تي تبديل نه ڪيو ويو، جيتوڻيڪ گهٽتائي اظهار جو ساڳيو خوراک تي منحصر رجحان ڏٺو ويو (شڪل 3d).
اسان فيشن ۽ فيوزن جي ضابطي ۾ شامل ڪلاسيڪل جينز جي اظهار جو پڻ جائزو ورتو. STOML2 کي فيوزن، مائيٽوفيگي ۽ بايوجينيسس ۾ شامل سمجهيو ويندو آهي، ۽ ان جو اظهار خاص طور تي 3 mM (2.4-گنا تبديلي) ۽ 5 mM (2.8-گنا تبديلي) PPA (شڪل 1) پاران گهٽجي ويو (p < 0.0001). ساڳئي طرح، OPA1 فيوزن جين جو اظهار 3 mM (1.6-گنا تبديلي) ۽ 5 mM (1.9-گنا تبديلي) PPA (p = 0.006 ۽ p = 0.0024، ترتيب وار) (شڪل 3f) تي گهٽجي ويو. تاهم، اسان کي 24-h PPA دٻاءُ (شڪل 3g–i) تحت فيوزن جينز MFN1، MFN2 يا فيشن جين DRP1 جي اظهار ۾ اهم فرق نه مليا. ان کان علاوه، اسان ڏٺو ته چار فيوزن ۽ فيشن پروٽين (OPA1، MFN1، MFN2 ۽ DRP1) جي سطح ساڳئي حالتن ۾ تبديل نه ٿيون (شڪل 4a-d). اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته اهي ڊيٽا وقت ۾ هڪ نقطي کي ظاهر ڪن ٿا ۽ شايد PPA دٻاءُ جي شروعاتي مرحلن دوران پروٽين جي اظهار يا سرگرمي جي سطحن ۾ تبديلين کي ظاهر نه ڪن. جڏهن ته، cMYC، NRF1، TFAM، STOML2، ۽ OPA1 جي اظهار ۾ اهم گهٽتائي مائيٽوڪونڊريل ميٽابولزم، بايوجينيسس، ۽ ڊائنامڪس جي اهم ٽرانسڪرپشنل ڊسي ريگيوليشن کي ظاهر ڪن ٿا. ان کان علاوه، اهي ڊيٽا مائيٽوڪونڊريل فنڪشن ۾ آخري رياست جي تبديلين جو سڌو سنئون مطالعو ڪرڻ لاءِ اميجنگ ٽيڪنڪ جي افاديت کي اجاگر ڪن ٿا.
پروپيونڪ ايسڊ (PPA) علاج کان پوءِ فيوزن ۽ فيشن فيڪٽر پروٽين جي سطح تبديل نه ٿي. SH-SY5Y سيلز کي 24 ڪلاڪن لاءِ 3 ۽ 5 mM PPA سان علاج ڪيو ويو. پروٽين جي سطحن کي مغربي بلٽ تجزيي ذريعي مقدار ۾ طئي ڪيو ويو، ۽ اظهار جي سطحن کي ڪل پروٽين تائين نارمل ڪيو ويو. سراسري پروٽين اظهار ۽ ٽارگيٽ ۽ ڪل پروٽين جا نمائندا مغربي بلاٽ ڏيکاريا ويا آهن. a - OPA1، b - MFN1، c - MFN2، d - DRP1. بار اوسط ± SEM جي نمائندگي ڪن ٿا، ۽ ڏيکاريل ڊيٽا n = 3 حياتياتي نقلن جا نمائندا آهن. ويرينس ۽ ڊنيٽ جي ٽيسٽ جي هڪ طرفي تجزيي کي استعمال ڪندي ڪيترائي مقابلو (p < 0.05) ڪيا ويا. اصل جيل ۽ بلاٽ شڪل S1 ۾ ڏيکاريا ويا آهن.
مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن ملٽي سسٽم بيمارين سان لاڳاپيل آهي جنهن ۾ ميٽابولڪ، دل ۽ عضلات جي بيمارين کان وٺي نيورولوجيڪل بيمارين تائين 1,10 شامل آهن. ڪيتريون ئي نيوروڊيجينريٽو ۽ نيوروڊيجينريٽو بيماريون مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن سان لاڳاپيل آهن، جيڪي دماغ جي سڄي عمر ۾ انهن عضون جي اهميت کي اجاگر ڪن ٿيون. انهن بيمارين ۾ پارڪنسن جي بيماري، الزائمر جي بيماري ۽ ASD3,4,18 شامل آهن. تنهن هوندي به، انهن بيمارين جو مطالعو ڪرڻ لاءِ دماغ جي ٽشو تائين رسائي ڏکيو آهي، خاص طور تي ميڪينيڪل سطح تي، سيلولر ماڊل سسٽم کي هڪ ضروري متبادل بڻائي ٿو. هن مطالعي ۾، اسان PPA-علاج ٿيل SH-SY5Y سيلز استعمال ڪندي هڪ سيلولر ماڊل سسٽم استعمال ڪندا آهيون ته جيئن نيورونل بيمارين، خاص طور تي آٽزم اسپيڪٽرم خرابين ۾ مشاهدو ڪيل مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن کي ٻيهر بيان ڪري سگهجي. نيورونز ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جو مطالعو ڪرڻ لاءِ هن PPA ماڊل کي استعمال ڪرڻ سان ASD جي ايٽولوجي ۾ بصيرت مهيا ٿي سگهي ٿي.
اسان مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۾ تبديلين کي ڏسڻ لاءِ TEM استعمال ڪرڻ جي امڪان جي ڳولا ڪئي. اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته TEM کي ان جي اثرائتي کي وڌائڻ لاءِ صحيح طور تي استعمال ڪيو وڃي. ڪرائو-نمونون جي تياري سيلولر اجزاء کي درست ڪرڻ ۽ آرٽيفيڪٽس جي ٺهڻ کي گهٽائڻ سان نيورونل ڍانچي جي بهتر تحفظ جي اجازت ڏئي ٿي 34. ان سان مطابقت رکندڙ، اسان ڏٺو ته نيورون جهڙيون SH-SY5Y سيلز ۾ برقرار سب سيلولر آرگنيل ۽ ڊگھا مائيٽوڪونڊريا هئا (شڪل 1a). هي نيورونل سيل ماڊلز ۾ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي جي مطالعي لاءِ ڪرائوجينڪ تياري جي طريقن جي افاديت کي اجاگر ڪري ٿو. جيتوڻيڪ TEM ڊيٽا جي مقصدي تجزيي لاءِ مقداري ماپون اهم آهن، اڃا تائين ڪو به اتفاق راءِ ناهي ته مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي تبديلين جي تصديق ڪرڻ لاءِ ڪهڙا مخصوص پيرا ميٽر ماپيا وڃن. وڏي تعداد ۾ مطالعي جي بنياد تي جيڪي مقداري طور تي مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي 17,31,32 جي جانچ ڪئي آهي، اسان هڪ خودڪار مائيٽوڪونڊريل تصويري تجزيو پائپ لائن تيار ڪئي جيڪا اٺ مورفولوجيڪل پيرا ميٽرز کي ماپي ٿي، يعني: علائقو، علائقو 2، اسپيڪٽ ريشو، پريميٽ، سرڪلرٽي، ڊگري، فيريٽ قطر. ۽ گولائي.
انهن مان، پي پي اي علائقي 2، ايراضي، دائري، ۽ فيريٽ قطر کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو (شڪل 1b-e). ان مان ظاهر ٿيو ته مائيٽوڪونڊريا ننڍو ۽ وڌيڪ گول ٿي ويو، جيڪو پوئين مطالعي سان مطابقت رکي ٿو جيڪو PPA30-حوصلہ افزائي مائيٽوڪونڊريا دٻاءُ جي 72 ڪلاڪن کان پوءِ مائيٽوڪونڊريا علائقي ۾ گهٽتائي ڏيکاري ٿو. اهي مورفولوجيڪل خاصيتون مائيٽوڪونڊريا فيشن کي ظاهر ڪري سگهن ٿيون، هڪ ضروري عمل جيڪو مائيٽوڪونڊريا نيٽ ورڪ مان خراب ٿيل حصن کي الڳ ڪرڻ لاءِ انهن جي تباهي کي فروغ ڏيڻ لاءِ mitophagy35,36,37. ٻئي طرف، سراسري مائيٽوڪونڊريا سائيز ۾ گهٽتائي وڌندڙ بايوجينيسس سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿي، جنهن جي نتيجي ۾ ننڍي نوزائشي مائيٽوڪونڊريا جي ٺهڻ جو نتيجو آهي. وڌايل فِشن يا بايوجينيسس مائيٽوڪونڊريا دٻاءُ جي خلاف مائيٽوسس کي برقرار رکڻ لاءِ هڪ معاوضي واري جواب جي نمائندگي ڪري ٿو. بهرحال، گهٽيل مائيٽوڪونڊريا واڌ، خراب فيوزن، يا ٻين حالتن کي خارج نٿو ڪري سگهجي.
جيتوڻيڪ TEM پاران ٺاهيل هاءِ ريزوليوشن تصويرون انفرادي مائيٽوڪونڊريا جي سطح تي مورفولوجيڪل خاصيتن جي تعين جي اجازت ڏين ٿيون، هي طريقو وقت ۾ هڪ ئي نقطي تي ٻه طرفي سنيپ شاٽ پيدا ڪري ٿو. ميٽابولڪ دٻاءُ جي متحرڪ جوابن جو مطالعو ڪرڻ لاءِ، اسان مائيٽوڪونڊريا کي TMRE سان اسٽين ڪيو ۽ MEL تجزيي سان ٽائيم ليپس مائڪروسڪوپي استعمال ڪئي، جيڪا وقت سان گڏ مائيٽوڪونڊريا نيٽ ورڪ ۾ تبديلين جي هاءِ-ٿرو پُٽ 3D ويزولائيزيشن جي اجازت ڏئي ٿي 33,38. اسان PPA دٻاءُ جي تحت مائيٽوڪونڊريا ڊائنامڪس ۾ نفيس پر اهم تبديلين جو مشاهدو ڪيو (شڪل 2). 3 ايم ايم تي، فيشن واقعن جو تعداد خاص طور تي وڌي ويو، جڏهن ته فيوزن واقعا ڪنٽرول ۾ ساڳيا رهيا. 5 ايم ايم پي پي اي تي فيشن ۽ فيوزن واقعن ٻنهي جي تعداد ۾ اضافو ڏٺو ويو، پر اهي تبديليون تقريبن متناسب هيون، اهو مشورو ڏئي ٿو ته فيشن ۽ فيوزن ڪينيٽڪس وڌيڪ ڪنسنٽريشن تي توازن تائين پهچن ٿا (شڪل 2b). سراسري مائيٽوڪونڊريا حجم 3 ۽ 5 ايم ايم پي پي اي ٻنهي تي تبديل نه ٿيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته مائيٽوڪونڊريا نيٽ ورڪ جي سالميت محفوظ هئي (شڪل 2d). هي متحرڪ مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪن جي صلاحيت کي ظاهر ڪري ٿو ته هو هلڪي ميٽابولڪ دٻاءُ جو جواب ڏين ته جيئن نيٽ ورڪ جي ٽڪراءَ جو سبب بڻجڻ کان سواءِ هوميوسٽاسس کي مؤثر طريقي سان برقرار رکي سگهجي. 3 ايم ايم پي پي اي تي، فيشن ۾ اضافو هڪ نئين توازن ڏانهن منتقلي کي فروغ ڏيڻ لاءِ ڪافي آهي، پر پي پي اي جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن جي ڪري پيدا ٿيندڙ دٻاءُ جي جواب ۾ وڌيڪ گہرا ڪائنيٽڪ ريموڊلنگ جي ضرورت آهي.
ٻنهي پي پي اي اسٽريس ڪنسنٽريشن تي مائيٽوڪونڊريا جو تعداد وڌيو، پر سراسري مائيٽوڪونڊريا جي مقدار ۾ ڪا خاص تبديلي نه آئي (شڪل 2c). اهو شايد بايوجينيسس ۾ واڌ يا ڊويزن ۾ واڌ جي ڪري هجي؛ جڏهن ته، اوسط مائيٽوڪونڊريا جي مقدار ۾ اهم گهٽتائي جي غير موجودگي ۾، اهو وڌيڪ امڪان آهي ته بايوسنٿيسس وڌي وڃي. جڏهن ته، شڪل 2 ۾ ڊيٽا ٻن معاوضي واري ميڪانيزم جي وجود جي حمايت ڪري ٿو: فيشن واقعن جي تعداد ۾ اضافو، مائيٽوڪونڊريا جي اپ ريگيوليشن سان مطابقت، ۽ واقعن جي تعداد ۾ اضافو، مائيٽوڪونڊريا جي بايوجينيسس سان مطابقت. آخرڪار، هلڪي دٻاءُ لاءِ متحرڪ معاوضي ۾ هڪ ئي وقت ۾ فيشن، فيوزن، بايوجينيسس، ۽ مائيٽوفيگي شامل ٿي سگهي ٿي. جيتوڻيڪ پوئين ليکڪن اهو ڏيکاريو آهي ته پي پي اي مائيٽوسس 30،39 ۽ مائيٽوفيگي 29 کي وڌائي ٿو، اسان پي پي اي جي جواب ۾ مائيٽوڪونڊريا جي فيشن ۽ فيوزن ڊائنامڪس جي ٻيهر جوڙجڪ لاءِ ثبوت فراهم ڪندا آهيون. اهي ڊيٽا ٽي اي ايم پاران مشاهدو ڪيل مورفولوجيڪل تبديلين جي تصديق ڪن ٿا ۽ پي پي اي-حوصلہ افزائي مائيٽوڪونڊريا جي خرابي سان لاڳاپيل ميڪانيزم ۾ وڌيڪ بصيرت فراهم ڪن ٿا.
ڇاڪاڻ ته نه ته TEM ۽ نه ئي MEL تجزيي مشاهدو ڪيل مورفولوجيڪل تبديلين جي بنياد تي جين ريگيوليٽري ميڪانيزم جو سڌو ثبوت فراهم ڪيو، اسان مائيٽوڪونڊريل ميٽابولزم، بايوجينيسس، ۽ ڊائنامڪس ۾ شامل جين جي آر اين اي اظهار جي جانچ ڪئي. cMYC پروٽو-آنڪوجين هڪ ٽرانسڪرپشن فيڪٽر آهي جيڪو مائيٽوڪونڊريل، گلائڪوليسس، امينو ايسڊ ۽ فيٽي ايسڊ ميٽابولزم جي ضابطي ۾ شامل آهي40. ان کان علاوه، cMYC مائيٽوڪونڊريل ٽرانسڪرپشن، ترجمو، ۽ پيچيده اسيمبلي ۾ شامل تقريبن 600 مائيٽوڪونڊريل جين جي اظهار کي منظم ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو، جنهن ۾ NRF1 ۽ TFAM41 شامل آهن. NRF1 ۽ TFAM mitosis جا ٻه مرڪزي ريگيوليٽر آهن، جيڪي mtDNA نقل کي چالو ڪرڻ لاءِ PGC-1α جي هيٺان وهڪرو ڪم ڪن ٿا. هي رستو cAMP ۽ AMPK سگنلنگ ذريعي چالو ٿئي ٿو ۽ توانائي جي خرچ ۽ ميٽابولڪ دٻاءُ لاءِ حساس آهي. اسان NFE2L2 جو پڻ جائزو ورتو، جيڪو مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس جو هڪ ريڊوڪس ريگيوليٽر آهي، اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا PPA جا اثر آڪسائيڊيو دٻاءُ ذريعي ثالث ٿي سگهن ٿا.
جيتوڻيڪ NFE2L2 اظهار ۾ ڪا تبديلي نه رهي، اسان 3 ايم ايم ۽ 5 ايم ايم پي پي اي سان 24 ڪلاڪن جي علاج کان پوءِ cMYC، NRF1 ۽ TFAM جي اظهار ۾ هڪ مستقل خوراک تي منحصر گهٽتائي ڏٺي (شڪل 3a-c). cMYC اظهار جي گهٽتائي کي اڳ ۾ مائيٽوڪونڊريل دٻاءُ 42 جي جواب جي طور تي رپورٽ ڪيو ويو آهي، ۽ ان جي برعڪس، cMYC اظهار جي گهٽتائي کي مائيٽوڪونڊريل ميٽابولزم، نيٽ ورڪ ڪنيڪٽيويٽي، ۽ جھلي پولرائيزيشن 43 کي ٻيهر ٺاهڻ سان مائيٽوڪونڊريل خرابي جو سبب بڻجي سگهي ٿي. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، cMYC پڻ مائيٽوڪونڊريل فيشن ۽ فيوزن 42،43 جي ضابطي ۾ شامل آهي ۽ سيل ڊويزن 44 دوران DRP1 فاسفوريليشن ۽ مائيٽوڪونڊريل لوڪلائيزيشن کي وڌائڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو، انهي سان گڏ نيورونل اسٽيم سيلز 45 ۾ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجيڪل ريموڊلنگ کي وچولي ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو. حقيقت ۾، cMYC جي گهٽتائي وارا فائبروبلاسٽ گهٽ ٿيل مائيٽوڪونڊريل سائيز کي ظاهر ڪن ٿا، PPA43 دٻاءُ جي ڪري ٿيندڙ تبديلين سان مطابقت رکن ٿا. اهي ڊيٽا cMYC ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جي وچ ۾ هڪ دلچسپ پر اڃا تائين غير واضح تعلق کي ظاهر ڪن ٿا، PPA دٻاءُ-حوصلہ افزائي ريموڊلنگ جي مستقبل جي مطالعي لاءِ هڪ دلچسپ هدف فراهم ڪن ٿا.
NRF1 ۽ TFAM جي گهٽتائي هڪ اهم ٽرانسڪرپشنل ايڪٽيويٽر جي حيثيت سان cMYC جي ڪردار سان مطابقت رکي ٿي. اهي ڊيٽا انساني ڪولن ڪينسر سيلز ۾ پوئين مطالعي سان پڻ مطابقت رکن ٿا جيڪي ڏيکارين ٿا ته PPA 22 ڪلاڪن تي NRF1 mRNA اظهار کي گهٽايو، جيڪو ATP جي گهٽتائي سان لاڳاپيل هو ۽ ROS46 وڌايو. انهن ليکڪن اهو پڻ ٻڌايو ته TFAM اظهار 8.5 ڪلاڪن تي وڌيو پر 22 ڪلاڪن تي بنيادي سطح تي واپس آيو. ان جي ابتڙ، Kim et al. (2019) ڏيکاريو ته SH-SY5Y سيلز ۾ PPA جي دٻاءُ جي 4 ڪلاڪن کان پوءِ TFAM mRNA اظهار ۾ نمايان گهٽتائي آئي؛ جڏهن ته، 72 ڪلاڪن کان پوءِ، TFAM پروٽين جو اظهار خاص طور تي وڌي ويو ۽ mtDNA ڪاپي نمبر خاص طور تي وڌي ويو. اهڙيءَ طرح، 24 ڪلاڪن کان پوءِ اسان ڏٺو ته mitochondrial biogenesis جين جي تعداد ۾ گهٽتائي ان امڪان کي خارج نٿو ڪري ته mitochondrial جي تعداد ۾ واڌ اڳوڻي وقت جي پوائنٽن تي بايوجينيسس جي چالو ٿيڻ سان لاڳاپيل آهي. پوئين مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته PPA 4 ڪلاڪ 30 منٽن تي SH-SY5Y سيلز ۾ PGC-1α mRNA ۽ پروٽين کي خاص طور تي اپ ريگيوليوٽ ڪري ٿو، جڏهن ته پروپيونڪ ايسڊ 12 ڪلاڪ 39 منٽن تي PGC-1α ذريعي گابي جي هيپاٽوسائٽس ۾ مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس کي وڌائي ٿو. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، PGC-1α نه رڳو NRF1 ۽ TFAM جو سڌو ٽرانسڪرپشنل ريگيوليٽر آهي، پر اهو پڻ ڏيکاريو ويو آهي ته اهو فيشن ۽ فيوزن کي منظم ڪندي MFN2 ۽ DRP1 جي سرگرمي کي منظم ڪري ٿو. گڏ ڪيو ويو، اهو PPA پاران پيدا ٿيندڙ مائيٽوڪونڊريل معاوضي جي جوابن کي منظم ڪرڻ واري ميڪانيزم جي ويجهي جوڙي کي نمايان ڪري ٿو. ان کان علاوه، اسان جو ڊيٽا PPA دٻاءُ هيٺ بايوجينيسس ۽ ميٽابولزم جي ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن جي اهم خرابي کي ظاهر ڪري ٿو.
STOML2، OPA1، MFN1، MFN2 ۽ DRP1 جين، مائيٽوڪونڊريل فيشن، فيوزن ۽ ڊائنامڪس جي مرڪزي ريگيوليٽرن مان آهن 37،48،49. مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۾ ڪيترائي ٻيا جين شامل آهن، جڏهن ته، STOML2، OPA1 ۽ MFN2 اڳ ۾ ASD ڪوهورٽس ۾ مختلف طور تي ميٿائليٽ ٿيل مليا آهن، 16 ۽ ڪيترن ئي آزاد مطالعي ۾ مائيٽوڪونڊريل دٻاءُ جي جواب ۾ انهن ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز ۾ تبديلين جي رپورٽ ڪئي وئي آهي 50،51. 52. OPA1 ۽ STOML2 ٻنهي جو اظهار 3 mM ۽ 5 mM PPA علاج (شڪل 3e، f) پاران خاص طور تي گهٽجي ويو. OPA1 MFN1 ۽ 2 سان سڌي رابطي ذريعي مائيٽوڪونڊريل فيوزن جي ڪلاسيڪل ريگيوليٽرن مان هڪ آهي ۽ ڪرسٽي ريموڊلنگ ۽ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۾ ڪردار ادا ڪري ٿو 53. مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۾ STOML2 جو صحيح ڪردار واضح ناهي، پر ثبوت اهو ظاهر ڪن ٿا ته اهو مائيٽوڪونڊريل فيوزن، بايوجينيسس، ۽ مائيٽوفيگي ۾ ڪردار ادا ڪري ٿو.
STOML2 مائيٽوڪونڊريل تنفس جي ميلاپ کي برقرار رکڻ ۽ تنفس جي زنجير جي ڪمپليڪس 54,55 جي ٺهڻ ۾ شامل آهي ۽ اهو ڏيکاريو ويو آهي ته ڪينسر جي سيلز جي ميٽابولڪ خاصيتن کي گہرا تبديل ڪري ٿو 56. مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته STOML2 BAN ۽ ڪارڊيو لپين 55,57,58 سان رابطي ذريعي مائيٽوڪونڊريل جھلي جي صلاحيت ۽ بايوجينيسس کي فروغ ڏئي ٿو. اضافي طور تي، آزاد مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته STOML2 ۽ PINK1 جي وچ ۾ رابطي mitophagy59,60 کي منظم ڪري ٿو. خاص طور تي، STOML2 کي MFN2 سان سڌو سنئون رابطي ۽ مستحڪم ڪرڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي ۽ OPA1 جي خرابي لاءِ ذميوار پروٽيز کي روڪيندي ڊگهي OPA1 آئسفارمز کي مستحڪم ڪرڻ ۾ پڻ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو 53,61,62. PPA رد عمل ۾ مشاهدو ڪيل STOML2 اظهار ۾ گهٽتائي انهن فيوزن پروٽين کي ubiquitin- ۽ proteasome-dependent pathways48 ذريعي تباهي لاءِ وڌيڪ حساس بڻائي سگهي ٿي. جيتوڻيڪ PPA جي متحرڪ جواب ۾ STOML2 ۽ OPA1 جو صحيح ڪردار واضح ناهي، انهن فيوزن جينز جي اظهار ۾ گهٽتائي (شڪل 3) فيشن ۽ فيوزن جي وچ ۾ توازن کي خراب ڪري سگهي ٿي ۽ مائيٽوڪونڊريل سائيز ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجي سگهي ٿي (شڪل 3). 1).
ٻئي طرف، OPA1 پروٽين جو اظهار 24 ڪلاڪن کان پوءِ به تبديل نه ٿيو، جڏهن ته MFN1، MFN2 يا DRP1 جي mRNA ۽ پروٽين جي سطح PPA علاج کان پوءِ خاص طور تي تبديل نه ٿي (شڪل 3g-i، شڪل 4). اهو ظاهر ڪري سگھي ٿو ته مائيٽوڪونڊريل فيوزن ۽ فيشن ۾ شامل انهن عنصرن جي ضابطي ۾ ڪا به تبديلي نه آئي آهي. بهرحال، اهو قابل ذڪر آهي ته انهن چئن جين مان هر هڪ پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ترميمن (PTMs) ذريعي پڻ منظم ڪيو ويندو آهي جيڪي پروٽين جي سرگرمي کي ڪنٽرول ڪن ٿا. OPA1 ۾ اٺ متبادل اسپلائس قسم آهن جيڪي ٻه الڳ آئسفارمز 63 پيدا ڪرڻ لاءِ مائيٽوڪونڊريل ۾ پروٽوليٽڪ طور تي ڪليو ٿيل آهن. ڊگهي ۽ مختصر آئسفارمز جي وچ ۾ توازن آخرڪار مائيٽوڪونڊريل فيوزن ۽ مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ جي سار سنڀال ۾ OPA1 جي ڪردار کي طئي ڪري ٿو64. DRP1 سرگرمي ڪلسيم/ڪلموڊولين-انحصار پروٽين ڪائنس II (CaMKII) فاسفوريليشن ذريعي منظم ڪئي ويندي آهي، جڏهن ته DRP1 جي تباهي ubiquitination ۽ SUMOylation65 ذريعي منظم ڪئي ويندي آهي. آخرڪار، DRP1 ۽ MFN1/2 ٻئي GTPases آهن، تنهن ڪري سرگرمي مائيٽوڪونڊريا 66 ۾ GTP پيداوار جي شرح کان متاثر ٿي سگهي ٿي. تنهن ڪري، جيتوڻيڪ انهن پروٽينن جو اظهار مسلسل رهي ٿو، اهو شايد تبديل نه ٿيندڙ پروٽين جي سرگرمي يا مقامي ڪرڻ کي ظاهر نه ڪري سگهي ٿو67,68. حقيقت ۾، موجوده PTM پروٽين ريپرٽوائر اڪثر ڪري تيز دٻاءُ جي جوابن جي وچولي لاءِ ذميوار دفاع جي پهرين لائن طور ڪم ڪن ٿا. اسان جي ماڊل ۾ اعتدال پسند ميٽابولڪ دٻاءُ جي موجودگي ۾، اهو ممڪن آهي ته PTM mRNA يا پروٽين جي سطح تي انهن جين جي اضافي چالو ڪرڻ جي ضرورت کان سواءِ مائيٽوڪونڊريا جي سالميت کي ڪافي طور تي بحال ڪرڻ لاءِ فيوزن ۽ فيشن پروٽين جي وڌندڙ سرگرمي کي فروغ ڏئي.
مٿي ڏنل ڊيٽا مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي جي پيچيده ۽ وقت تي منحصر ضابطي ۽ انهن ميڪانيزم کي واضح ڪرڻ جي چئلينجن کي اجاگر ڪري ٿو. جين جي اظهار جو مطالعو ڪرڻ لاءِ، پهرين رستي ۾ مخصوص ٽارگيٽ جين کي سڃاڻڻ ضروري آهي. جڏهن ته، اسان جو ڊيٽا ڏيکاري ٿو ته ساڳئي رستي ۾ جين ساڳئي دٻاءُ جو ساڳئي طريقي سان جواب نه ڏيندا آهن. حقيقت ۾، پوئين مطالعي ڏيکاريو آهي ته ساڳئي رستي ۾ مختلف جين مختلف وقتي ردعمل پروفائلز 30,46 ڏيکاري سگهن ٿا. ان کان علاوه، پيچيده پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ميڪانيزم آهن جيڪي ٽرانسڪرپشن ۽ جين فنڪشن جي وچ ۾ تعلق کي خراب ڪن ٿا. پروٽومڪ اسٽڊيز PTMs ۽ پروٽين فنڪشن جي اثر ۾ بصيرت فراهم ڪري سگهن ٿا، پر اهي گهٽ-ٿرو پُٽ طريقا، اعلي سگنل-کان-شور تناسب، ۽ خراب ريزوليوشن سميت چئلينج پڻ پيدا ڪن ٿا.
هن حوالي سان، TEM ۽ MEL استعمال ڪندي مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي جو مطالعو ڪرڻ ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۽ فنڪشن جي وچ ۾ تعلق ۽ اهو ڪيئن بيماري تي اثر انداز ٿئي ٿو بابت بنيادي سوالن کي حل ڪرڻ جي وڏي صلاحيت آهي. سڀ کان اهم ڳالهه اها آهي ته TEM مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس ۽ ڊائنامڪس جي ڪنورجنٽ اينڊ پوائنٽ جي طور تي مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي کي ماپڻ لاءِ هڪ سڌو طريقو فراهم ڪري ٿو51. MEL ٽي-dimensional سيلولر ماحول ۾ فيشن ۽ فيوزن واقعن کي ڏسڻ لاءِ هڪ سڌو طريقو پڻ فراهم ڪري ٿو، جين جي اظهار ۾ تبديلين جي غير موجودگي ۾ به متحرڪ مائيٽوڪونڊريل ريموڊلنگ جي مقدار کي اجازت ڏئي ٿو33. هتي اسان ثانوي مائيٽوڪونڊريل بيمارين ۾ مائيٽوڪونڊريل اميجنگ ٽيڪنڪ جي افاديت کي اجاگر ڪريون ٿا. اهي بيماريون عام طور تي دائمي نرم ميٽابولڪ دٻاءُ جي ڪري نمايان آهن جيڪي تيز مائيٽوڪونڊريل نقصان جي بدران مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪن جي ذيلي ريموڊلنگ جي ڪري آهن. بهرحال، دائمي دٻاءُ هيٺ مائيٽوسس کي برقرار رکڻ لاءِ گهربل مائيٽوڪونڊريل معاوضي جا گہرا فنڪشنل نتيجا آهن. نيورو سائنس جي حوالي سان، انهن معاوضي واري ميڪانيزم جي بهتر سمجھڻ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس سان لاڳاپيل پليوٽروپڪ نيوروپيٿولوجي بابت اهم معلومات فراهم ڪري سگهي ٿي.
آخرڪار، اسان جو ڊيٽا جين جي اظهار، پروٽين جي تبديلين، ۽ پروٽين جي سرگرمي جي وچ ۾ پيچيده رابطي جي فنڪشنل نتيجن کي سمجهڻ لاءِ تصويري ٽيڪنڪ جي افاديت کي اجاگر ڪري ٿو جيڪي نيورونل مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس کي ڪنٽرول ڪن ٿا. اسان ASD جي مائيٽوڪونڊريل جزو ۾ بصيرت حاصل ڪرڻ لاءِ نيورونل سيل ماڊل ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن کي ماڊل ڪرڻ لاءِ PPA استعمال ڪيو. PPA سان علاج ڪيل SH-SY5Y سيلز مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۾ تبديليون ڏيکاريون: مائيٽوڪونڊريا ننڍا ۽ گول ٿي ويا، ۽ TEM پاران مشاهدو ڪرڻ تي ڪرسٽي خراب طور تي بيان ڪيا ويا. MEL تجزيو ڏيکاري ٿو ته اهي تبديليون هلڪي ميٽابولڪ دٻاءُ جي جواب ۾ مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ کي برقرار رکڻ لاءِ فيشن ۽ فيوزن واقعن ۾ واڌ سان گڏ ٿينديون آهن. ان کان علاوه، PPA خاص طور تي مائيٽوڪونڊريل ميٽابولزم ۽ هوميوسٽاسس جي ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن کي خراب ڪري ٿو. اسان cMYC، NRF1، TFAM، STOML2، ۽ OPA1 کي PPA دٻاءُ جي ڪري خراب ٿيل اهم مائيٽوڪونڊريل ريگيوليٽر جي طور تي سڃاڻپ ڪئي ۽ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي ۽ فنڪشن ۾ PPA-حوصلہ افزائي تبديلين جي وچ ۾ ڪردار ادا ڪري سگھن ٿا. مستقبل جي مطالعي جي ضرورت آهي ته جين جي اظهار ۽ پروٽين جي سرگرمي، لوڪلائيزيشن، ۽ پوسٽ-ٽرانسليشنل تبديلين ۾ PPA-حوصلہ افزائي عارضي تبديلين کي بهتر طور تي بيان ڪيو وڃي. اسان جو ڊيٽا مائيٽوڪونڊريل دٻاءُ جي جواب ۾ ثالثي ڪندڙ ريگيوليٽري ميڪانيزم جي پيچيدگي ۽ باهمي انحصار کي اجاگر ڪري ٿو ۽ وڌيڪ ٽارگيٽ ڪيل ميڪاني مطالعي لاءِ TEM ۽ ٻين تصويري طريقن جي افاديت کي ظاهر ڪري ٿو.
SH-SY5Y سيل لائن (ECACC, 94030304-1VL) سگما-الڊرچ کان خريد ڪئي وئي هئي. SH-SY5Y سيلز ڊبلبيڪو جي تبديل ٿيل ايگل جي ميڊيم/F-12 غذائي مرکب (DMEM/F-12) ۽ L-گلوٽامائن (SC09411، سائنس سيل) ۾ 25 سينٽي ميٽر 2 فلاسڪس ۾ پوکيا ويا هئا جن ۾ 20٪ فيٽل بووائن سيرم (FBS) (10493106، ThermoFisher Scientific) ۽ 1٪ پينسلين-اسٽريپٽومائسن (P4333-20ML، سگما-الڊرچ) 37 °C، 5٪ CO2 سان گڏ شامل ڪيو ويو هو. سيلز کي 0.05٪ ٽرپسن-اي ڊي ٽي اي (15400054، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪندي 80٪ سنگم تي سب ڪلچر ڪيو ويو، 300 گرام تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ تقريبن 7 × 105 سيلز/ملي جي کثافت تي پليٽ ڪيو ويو. سڀئي تجربا غير فرق ٿيل SH-SY5Y سيلز تي 19-22 پاسن جي وچ ۾ ڪيا ويا. PPA کي NaP طور ڏنو ويندو آهي. NaP پائوڊر (CAS نمبر 137-40-6، ڪيميائي فارمولا C3H5NaO2، P5436-100G، سگما-الڊرچ) کي گرم MilliQ پاڻي ۾ 1 M جي ڪنسنٽريشن تائين حل ڪريو ۽ 4 °C تي ذخيرو ڪريو. علاج جي ڏينهن تي، هن محلول کي 1 M PPA کان 3 mM ۽ 5 mM PPA سان سيرم فري ميڊيم (DMEM/F-12 L-glutamine سان) ۾ ملائي ڇڏيو. سڀني تجربن لاءِ علاج جي ڪنسنٽريشن ڪو پي پي اي (0 ايم ايم، ڪنٽرول)، 3 ايم ايم، ۽ 5 ايم ايم پي پي اي نه هئي. تجربا گهٽ ۾ گهٽ ٽن حياتياتي نقلن ۾ ڪيا ويا.
SH-SY5Y سيلز کي 5.5 × 105 سيلز/ml جي شرح سان 25 cm5 فلاسڪس ۾ ٻج ڪيو ويو ۽ 24 ڪلاڪن تائين وڌايو ويو. انڪيوبيشن جي 24 ڪلاڪن کان اڳ فلاسڪ ۾ PPA علاج شامل ڪيو ويو. عام ممالين ٽشو سب ڪلچر پروٽوڪول (مٿي بيان ڪيل) جي پيروي ڪندي سيل پيلٽس گڏ ڪريو. سيل پيلٽ کي 100 µl 2.5٪ گلوٽاراالڊيهائيڊ، 1× PBS ۾ ٻيهر معطل ڪريو ۽ پروسيسنگ تائين 4 °C تي ذخيرو ڪريو. SH-SY5Y سيلز کي مختصر طور تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ته جيئن سيلز کي پيلٽ ڪري سگهجي ۽ 2.5٪ گلوٽاراالڊيهائيڊ، 1× PBS محلول ڪڍي سگهجي. ڊسٽلڊ واٽر ۾ تيار ڪيل 4٪ اگروز جيل ۾ سلڊٽ کي ٻيهر معطل ڪريو (اگروز ۽ سلڊٽ جي مقدار جو تناسب 1:1 آهي). اگروز جا ٽڪرا فليٽ پليٽن تي گرڊ تي رکيا ويا ۽ هاءِ پريشر منجمد ٿيڻ کان اڳ 1-هيڪساڊيسين سان ڍڪيل هئا. نمونا 100٪ خشڪ ايسٽون ۾ -90 °C تي 24 ڪلاڪن لاءِ منجمد ڪيا ويا. پوءِ گرمي پد -80 °C تائين وڌايو ويو ۽ 1٪ اوسميم ٽيٽرو آڪسائيڊ ۽ 0.1٪ گلوٽاراالڊيهائيڊ جو محلول شامل ڪيو ويو. نمونن کي -80 °C تي 24 ڪلاڪن لاءِ ذخيرو ڪيو ويو. ان کان پوءِ، گرمي پد کي ڪيترن ئي ڏينهن تائين بتدريج ڪمري جي حرارت تائين وڌايو ويو: -80 °C کان -50 °C تائين 24 ڪلاڪن لاءِ، -30 °C تائين 24 ڪلاڪن لاءِ، -10 °C تائين 24 ڪلاڪن لاءِ ۽ آخرڪار ڪمري جي حرارت تائين.
ڪرائيوجينڪ تياري کان پوءِ، نمونن کي رال سان متاثر ڪيو ويو ۽ الٽرا ٿن سيڪشن (~100 nm) هڪ ليڪا ريچرٽ الٽرا ڪٽ ايس الٽرا مائڪروٽوم (ليڪا مائڪرو سسٽم) استعمال ڪندي ٺاهيا ويا. حصن کي 2٪ يورينيل ايسٽيٽ ۽ ليڊ سائٽريٽ سان رنگيو ويو. نمونن کي FEI ٽيڪني 20 ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپ (ٿرمو فشر (اڳوڻي FEI)، آئنڊ هوون، نيدرلينڊ) استعمال ڪندي ڏٺو ويو جيڪو 200 kV (ليب 6 ٽرانسميٽر) تي ڪم ڪري ٿو ۽ هڪ گيٽن سي سي ڊي ڪئميرا (گيٽن، برطانيه) جيڪو ٽريڊيم انرجي فلٽر سان ليس آهي.
هر ٽيڪنيڪل نقل ۾، گهٽ ۾ گهٽ 24 سنگل سيل تصويرون حاصل ڪيون ويون، ڪل 266 تصويرون. سڀني تصويرن جو تجزيو دلچسپي جي علائقي (ROI) ميڪرو ۽ ميٽوڪونڊريا ميڪرو استعمال ڪندي ڪيو ويو. مائيٽوڪونڊريل ميڪرو شايع ٿيل طريقن 17,31,32 تي ٻڌل آهي ۽ فجي/ImageJ69 ۾ TEM تصويرن جي نيم خودڪار بيچ پروسيسنگ جي اجازت ڏئي ٿو. مختصر ۾: تصوير کي رولنگ بال پس منظر جي گھٽتائي (60 پکسل ريڊيس) ۽ هڪ FFT بينڊ پاس فلٽر (ترتيب وار 60 ۽ 8 پکسل اپر ۽ لوئر بائونڊ استعمال ڪندي) ۽ عمودي لائن سپريشن 5٪ جي اورينٽيشن رواداري سان استعمال ڪندي الٽي ۽ الٽي ڪئي وئي آهي. پروسيس ٿيل تصوير کي وڌ ۾ وڌ اينٽراپي الگورتھم استعمال ڪندي خودڪار طريقي سان حد بندي ڪئي وئي آهي ۽ هڪ بائنري ماسڪ پيدا ڪيو ويو آهي. خام TEM تصويرن ۾ دستي طور تي چونڊيل ROI سان لاڳاپيل تصويري علائقا ڪڍيا ويا، مائيٽوڪونڊريا جي خاصيت ۽ پلازما جھلي ۽ ٻين اعلي برعڪس علائقن کي خارج ڪندي. هر ڪڍيل ROI لاءِ، 600 پکسلز کان وڏا بائنري ذرڙا تجزيو ڪيا ويا، ۽ ذرڙن جي ايراضي، پريميٽ، ميجر ۽ مائنر محور، فيريٽ قطر، گولائي، ۽ سرڪيولريٽي کي فجي/ImageJ جي بلٽ ان ماپ فنڪشن استعمال ڪندي ماپيو ويو. Merrill، Flippo، ۽ Strack (2017) جي پٺيان، علائقو 2، ذرڙن جي اسپيڪٽ ريشو (ميجر کان مائنر محور تناسب)، ۽ شڪل فيڪٽر (FF) انهن ڊيٽا مان ڳڻيو ويو، جتي FF = پريميٽ 2/4pi x ايريا. پيرا ميٽرڪ فارمولا جي تعريف Merrill، Flippo، ۽ Strack (2017) ۾ ملي سگهي ٿي. ذڪر ڪيل ميڪرو GitHub تي موجود آهن (ڊيٽا دستيابي بيان ڏسو). سراسري طور تي، تقريبن 5,600 ذرڙن جو تجزيو في PPA علاج ڪيو ويو، ڪل تقريبن 17,000 ذرڙن لاءِ (ڊيٽا نه ڏيکاريو ويو آهي).
SH-SH5Y سيلز کي 8-چيمبر ڪلچر ڊشز (ThermoFisher, #155411) ۾ رکيو ويو ته جيئن رات جو چپڪندڙ ٿي سگهي ۽ پوءِ TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ۽ Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. رنگائي. تصويرون 10 منٽ جي ماحول تي 405 nm ۽ 561 nm ليزر استعمال ڪندي حاصل ڪيون ويون، ۽ خام تصويرون z-اسٽيڪ جي طور تي حاصل ڪيون ويون جن ۾ 10 تصويري مائڪروگرافس شامل هئا جن ۾ تصوير جي فريم جي وچ ۾ 0.2 μm جي az قدم سان 12 بعد واري وقت جي پوائنٽن تي. تصويرون ڪارل زيس LSM780 ELYRA PS.1 سپر ريزوليوشن پليٽ فارم (ڪارل زيس، اوبرڪوچن، جرمني) استعمال ڪندي LCI پلان اپوڪروميٽ 100x/1.4 آئل DIC M27 لينس استعمال ڪندي گڏ ڪيون ويون. ImageJ ۾ تصويرن جو تجزيو اڳ ۾ بيان ڪيل پائپ لائن ۽ ImageJ پلگ ان استعمال ڪندي ڪيو ويو ته جيئن فيوزن ۽ فيشن واقعن، مائيٽوڪونڊريل ڍانچي جي سراسري تعداد، ۽ في سيل 33 جي سراسري مائيٽوڪونڊريل حجم کي ماپي سگهجي. MEL ميڪرو GitHub تي موجود آهن (ڊيٽا دستيابي بيان ڏسو).
علاج کان اڳ 24 ڪلاڪن تائين 0.3 × 106 سيلز/mL جي کثافت تي ڇهن ويل پليٽن ۾ SH-SY5Y سيلز کي وڌايو ويو. آر اين اي کي Quick-RNA™ Miniprep پروٽوڪول (ZR R1055، Zymo Research) استعمال ڪندي ٿورين تبديلين سان ڪڍيو ويو: هٽائڻ کان اڳ هر ويل ۾ 300 μl RNA lysis بفر شامل ڪريو ۽ هر نموني کي آخري قدم طور 30 ​​μl DNase/RNase elution سان لائز ڪريو. - مفت پاڻي. سڀني نمونن کي NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer استعمال ڪندي مقدار ۽ معيار لاءِ چيڪ ڪيو ويو. سيل لائسيٽس مان ڪل پروٽين 200 μl RIPA lysis بفر استعمال ڪندي حاصل ڪيو ويو، ۽ پروٽين جي ڪنسنٽريشن کي بريڊفورڊ پروٽين ايسي 70 استعمال ڪندي مقدار ۾ طئي ڪيو ويو.
سي ڊي اين اي سنٿيسس ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق ڪجهه ترميمن سان ٽيٽرو™ سي ڊي اين اي سنٿيسس ڪٽ (BIO-65043، ميريڊين بايو سائنس) استعمال ڪندي ڪيو ويو. سي ڊي اين اي کي ڪل آر اين اي جي 0.7 کان 1 μg استعمال ڪندي 20-μl رد عمل ۾ سنٿيسس ڪيو ويو. پرائمر اڳ ۾ شايع ٿيل پيپرز 42، 71، 72، 73، 74، 75، 76، 77، 78 (ٽيبل S1) مان چونڊيا ويا هئا ۽ ان سان گڏ پروب انٽيگريٽڊ ڊي اين اي ٽيڪنالاجيز جي پرائمر ڪيوسٽ ٽول استعمال ڪندي ٺاهيا ويا هئا. دلچسپي جي سڀني جين کي نيوڪليئر B2M جين ڏانهن نارمل ڪيو ويو. STOML2، NRF1، NFE2L2، TFAM، cMYC ۽ OPA1 جي جين اظهار کي RT-qPCR ذريعي ماپيو ويو. ماسٽر مڪس ۾ LUNA Taq پوليمريز (M3003L، نيو انگلينڊ بايولابس)، 10 μM فارورڊ ۽ ريورس پرائمر، cDNA، ۽ PCR-گريڊ پاڻي شامل هئا ته جيئن هر رد عمل لاءِ 10 μL جو آخري حجم حاصل ٿئي. ڊويزن ۽ فيشن جينز (DRP1، MFN1/2) جي اظهار کي TaqMan ملٽي پلڪس اسيس استعمال ڪندي ماپيو ويو. Luna Universal Probe qPCR ماسٽر مڪس (M3004S، نيو انگلينڊ بايولابس) ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق معمولي تبديلين سان استعمال ڪيو ويو. ملٽي پلڪس RT-qPCR ماسٽر مڪس ۾ 1X LUNA Taq پوليمريز، 10 μM فارورڊ ۽ ريورس پرائمر، 10 μM پروب، cDNA، ۽ PCR-گريڊ پاڻي شامل آهن، جنهن جي نتيجي ۾ هر رد عمل لاءِ 20 μL جو آخري حجم پيدا ٿيو. RT-qPCR روٽر-جين Q 6-پليڪس (QIAGEN RG—سيريل نمبر: R0618110) استعمال ڪندي ڪيو ويو. سائيڪل هلائڻ جون حالتون ٽيبل S1 ۾ ڏيکاريل آهن. سڀني سي ڊي اين اي نمونن کي ٽرپليڪيٽ ۾ وڌايو ويو ۽ ڏهه ڀيرا ڊائليشن جي هڪ سيريز استعمال ڪندي هڪ معياري وکر پيدا ڪيو ويو. سائيڪل حد معياري انحراف (Ct) >0.5 سان ٽرپليڪيٽ نمونن ۾ آئوٽليئرز کي تجزيو مان هٽايو ويو ته جيئن ڊيٽا جي پيداوار کي يقيني بڻائي سگهجي30,72. لاڳاپيل جين اظهار جو حساب 2-ΔΔCt79 طريقو استعمال ڪندي ڪيو ويو.
پروٽين جا نمونا (60 μg) 2:1 جي تناسب سان ليملي لوڊنگ بفر سان ملايا ويا ۽ 12٪ بي رنگ پروٽين جيل (بايو-ريڊ #1610184) تي هلايا ويا. پروٽين کي ٽرانس-بلاٽ ٽربو سسٽم (#170-4155، بايو-ريڊ) استعمال ڪندي PVDF (پوليوينيلائيڊين فلورائيڊ) جھلي (#170-84156، بايو-ريڊ) ڏانهن منتقل ڪيو ويو. جھلي کي بلاڪ ڪيو ويو ۽ مناسب پرائمري اينٽي باڊيز (OPA1، MFN1، MFN2، ۽ DRP1) (1:1000 کي گھٽائي) سان 48 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ان کان پوءِ سيڪنڊري اينٽي باڊيز (1:10,000) سان 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيشن ڪيو ويو. پوءِ جھليون ڪلارٽي ويسٽرن اي سي ايل سبسٽريٽ (#170-5061، بايو-ريڊ) استعمال ڪندي تصوير ڪيون ويون ۽ بايو-ريڊ ڪيمي ڊاڪ ايم پي سسٽم استعمال ڪندي رڪارڊ ڪيون ويون. ويسٽرن بلاٽ تجزيي لاءِ ImageLab ورجن 6.1 استعمال ڪيو ويو. اصل جيل ۽ بلاٽ شڪل S1 ۾ ڏيکاريل آهن. اينٽي باڊي جي معلومات ٽيبل S2 ۾ مهيا ڪئي وئي آهي.
ڊيٽا سيٽ گهٽ ۾ گهٽ ٽن آزاد نمونن جي اوسط (SEM) جي اوسط ۽ معياري غلطي جي طور تي پيش ڪيا ويا آهن. ڊيٽا سيٽ کي گيوسين ورڇ ۽ برابر معياري انحراف کي فرض ڪرڻ ۽ تجزين سان اڳتي وڌڻ کان اڳ شيپيرو-ولڪس ٽيسٽ (جيستائين ٻي صورت ۾ نه چيو وڃي) استعمال ڪندي نارملٽي لاءِ جانچيو ويو. فشر جي MEL LSD (p < 0.05)، هڪ طرفي ANOVA (علاج بمقابله ڪنٽرول مطلب)، ۽ ڊنيٽ جي گھڻن مقابلي واري ٽيسٽ کي استعمال ڪندي ڊيٽا سيٽ جو تجزيو ڪرڻ کان علاوه اهميت کي طئي ڪرڻ لاءِ (p < 0.05). اهم p قدر گراف ۾ *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001 جي طور تي ڏيکاريا ويا آهن. سڀئي شمارياتي تجزيا ۽ گراف گراف پيڊ پرزم 9.4.0 استعمال ڪندي ڪيا ويا ۽ ٺاهيا ويا.
ٽي اي ايم تصويري تجزيي لاءِ فجي/اميج جي ميڪرو گٽ هب تي عوامي طور تي دستياب آهن: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. مائيٽوڪونڊريل ايونٽ لوڪٽر (MEL) ميڪرو گٽ هب تي عوامي طور تي دستياب آهي: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
ميليانا اي.، ديوي اين ايم ۽ وجيا اي. ميٽوڪونڊريا: ميٽابولزم، هوميوسٽاسس، دٻاءُ، عمر ۽ ايپي جينيٽيڪس جا ماسٽر ريگيوليٽر. انڊونيشيائي. بايوميڊيڪل سائنس. جي. 13، 221–241 (2021).
بين-شاچار، ڊي. شيزوفرينيا ۾ گھڻ رخي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن، هڪ ممڪن پيٿولوجيڪل ٽارگيٽ جي طور تي ڪمپليڪس I. شيزوفرينيا. وسيلو. 187، 3-10 (2017).
بوس، اي. ۽ بيل، ايم ايف پارڪنسن جي بيماري ۾ مائٽوڪنڊريل ڊسڪشن. جي. نيورو ڪيمسٽري. 139، 216-231 (2016).
شرما وي ڪي، سنگهه ٽي جي ۽ مهتا وي. زوردار مائيٽوڪونڊريا: الزائمر جي بيماري ۾ حملي جا نشان. مائيٽوڪونڊريا 59، 48-57 (2021).
بيلينگور پي.، ڊوارٽ جي ايم اين، شوڪ پي ايف ۽ فريرا جي ڪي مائيٽوڪونڊريا ۽ دماغ: بايو انرجيٽڪس ۽ وڌيڪ. نيوروٽوڪسن. وسيلو. 36، 219-238 (2019).
رنگاراجو، وي. وغيره. پليوٽروپڪ مائيٽوڪونڊريا: نيورونل ترقي ۽ بيماري تي مائيٽوڪونڊريا جو اثر. جي. نيورو سائنس. 39، 8200-8208 (2019).
ڪارڊانو-راموس، سي. ۽ موريس، وي اي نيورونز ۾ مائيٽوڪونڊريل بايوجينيسس: ڪيئن ۽ ڪٿي. بين الاقواميت. جي. موهر. سائنس. 22، 13059 (2021).
يو، آر.، لينڊال، يو.، نسٽر، ايم. ۽ زاؤ، جي. ممالين مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس جو ضابطو: موقعا ۽ چئلينج. فرنٽ. اينڊوڪرين. (لوزين) 11، 374 (2020).
خاچو، ايم. ۽ سليڪ، آر ايس نيوروجينيسس جي ضابطي ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس: ترقي ڪندڙ دماغ کان بالغ دماغ تائين. ترقي. متحرڪ. 247، 47-53 (2018).