موجوده *موجوده پتو: ڪولون 50931، جرمني، ڪولون ايڪسيلنس ڪلسٽر ريسرچ آن سيلولر اسٽريس ريسپانس ان ايجنگ سان لاڳاپيل بيمارين (CECAD).
مائيٽوڪونڊريل بيمارين جي نيوروڊيجنريشن کي ناقابلِ واپسي سمجهيو ويندو آهي ڇاڪاڻ ته نيورونز جي ميٽابولڪ پلاسٽيسيٽي محدود آهي، پر جسم ۾ نيورونل ميٽابولزم جي سيل خودمختياري تي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جو اثر خراب طور تي سمجهي نه سگهيو آهي. هتي، اسان پورڪينج نيورونز جي سيل-مخصوص پروٽيم کي ترقي پسند OXPHOS جي گهٽتائي سان متعارف ڪرايون ٿا جيڪو مائيٽوڪونڊريل فيوزن ڊائنامڪس ۾ خلل جي ڪري پيدا ٿيو. اسان ڏٺو ته مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن پروٽيمڪس جي ميدان ۾ هڪ گهري تبديلي کي جنم ڏنو، جيڪو آخرڪار سيل جي موت کان اڳ صحيح ميٽابولڪ پروگرامن جي ترتيب وار چالو ڪرڻ جو سبب بڻيو. غير متوقع طور تي، اسان پائروويٽ ڪاربوڪسيلس (PCx) ۽ ٻين اينٽي ايجنگ اينزائمز جي واضح انڊڪشن جو تعين ڪيو جيڪي TCA چڪر جي وچولي کي پورو ڪن ٿا. PCx جي روڪٿام آڪسائيڊيو اسٽريس ۽ نيوروڊيجنريشن کي وڌائي ڇڏيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ايٿيروسکلروسس جو OXPHOS جي کوٽ وارن نيورونز ۾ حفاظتي اثر آهي. آخري طور تي خراب ٿيل نيورونز ۾ مائيٽوڪونڊريل فيوزن جي بحالي انهن ميٽابولڪ خاصيتن کي مڪمل طور تي رد ڪري ٿي، ان ڪري سيل جي موت کي روڪي ٿي. اسان جا نتيجا اڳ ۾ اڻڄاتل رستن جي سڃاڻپ ڪن ٿا جيڪي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن کي لچڪ ڏين ٿا ۽ ڏيکارين ٿا ته بيماري جي آخري مرحلن ۾ به نيوروڊيجنريشن کي رد ڪري سگهجي ٿو.
نيورونل توانائي ميٽابولزم کي برقرار رکڻ ۾ مائيٽوڪونڊريا جو مرڪزي ڪردار انساني مائيٽوڪونڊريل بيمارين سان لاڳاپيل وسيع نيورولوجيڪل علامتن جي ڪري زور ڏنو ويو آهي. انهن مان گھڻا بيماريون جين ميوٽيشنز جي ڪري ٿين ٿيون جيڪي مائيٽوڪونڊريل جين اظهار کي منظم ڪن ٿيون (1، 2) يا مائيٽوڪونڊريل ڊائنامڪس سان لاڳاپيل جين تباهي، جيڪا اڻ سڌي طرح مائيٽوڪونڊريل ڊي اين اي (mtDNA) جي استحڪام کي متاثر ڪري ٿي (3، 4). جانورن جي ماڊلز ۾ ڪم ڏيکاريو ويو آهي ته آس پاس جي ٽشوز ۾ مائيٽوڪونڊريل خرابي جي جواب ۾، قدامت پسند ميٽابولڪ رستا (5-7) چالو ٿي سگهن ٿا، جيڪو انهن پيچيده بيمارين جي پيٿوجينيسس جي کوٽائي کي سمجهڻ لاءِ اهم معلومات فراهم ڪري ٿو. بلڪل برعڪس، دماغ جي مائيٽوڪونڊريل ايڊينوسين ٽرائيفاسفيٽ (ATP) جي پيداوار جي عام ناڪامي جي ڪري مخصوص سيل قسمن جي ميٽابولڪ تبديلين جي اسان جي سمجھ بنيادي آهي (8)، علاج جي هدفن کي سڃاڻڻ جي ضرورت تي زور ڏئي ٿو جيڪي بيماري کي روڪڻ يا روڪڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجن ٿا. نيوروڊيجنريشن کي روڪيو (9). معلومات جي کوٽ اها حقيقت آهي ته اعصاب سيلز کي وڏي پيماني تي سمجهيو ويندو آهي ته انهن جي آس پاس جي ٽشوز جي سيل قسمن جي مقابلي ۾ تمام محدود ميٽابولڪ لچڪ آهي (10). ڏنو ويو آهي ته اهي سيلز سيناپٽڪ ٽرانسميشن کي فروغ ڏيڻ ۽ زخم ۽ بيماري جي حالتن جو جواب ڏيڻ لاءِ نيورونز کي ميٽابولائٽس جي فراهمي کي هم آهنگ ڪرڻ ۾ مرڪزي ڪردار ادا ڪن ٿا، دماغي ٽشوز جي چئلينجنگ حالتن ۾ سيل ميٽابولزم کي اپنائڻ جي صلاحيت تقريبن گليئل سيلز تائين محدود آهي (11-14). ان کان علاوه، دماغي ٽشوز جي موروثي سيلولر هيٽروجينيٽي وڏي حد تائين ميٽابولڪ تبديلين جي مطالعي ۾ رڪاوٽ بڻجي ٿي جيڪي مخصوص نيورونل ذيلي گروپن ۾ ٿينديون آهن. نتيجي طور، نيورونز ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي صحيح سيلولر ۽ ميٽابولڪ نتيجن بابت ٿورو ئي ڄاڻ آهي.
مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي ميٽابولڪ نتيجن کي سمجهڻ لاءِ، اسان پورڪنجي نيورونز (PNs) کي نيوروڊيجنريشن جي مختلف مرحلن ۾ الڳ ڪيو جيڪو مائيٽوڪونڊريل آئوٽر ميمبرين فيوزن (Mfn2) جي تباهي جي ڪري ٿئي ٿو. جيتوڻيڪ انسانن ۾ Mfn2 ميوٽيشنز موروثي موٽر سينسري نيوروپيٿي جي هڪ شڪل سان لاڳاپيل آهن جنهن کي چارڪوٽ-ميري-ٽٿ ٽائپ 2A (15) جي نالي سان سڃاتو وڃي ٿو، چوٿين ۾ Mfn2 جي مشروط تباهي آڪسائيڊيشن جي هڪ چڱي طرح تسليم ٿيل انڊڪشن آهي فاسفوريليشن (OXPHOS) ڊسڪشن طريقو. مختلف نيورونل ذيلي قسم (16-19) ۽ نتيجي ۾ پيدا ٿيندڙ نيوروڊيجنريٽو فينوٽائپ ترقي پسند نيورولوجيڪل علامتن سان گڏ آهن، جهڙوڪ حرڪت جي خرابي (18، 19) يا سيريبيلر ايٽيڪسيا (16). ليبل فري مقداري (LFQ) پروٽومڪس، ميٽابولومڪس، اميجنگ، ۽ وائرولوجيڪل طريقن جي ميلاپ کي استعمال ڪندي، اسان ڏيکاريون ٿا ته ترقي پسند نيوروڊيجنريشن پائروويٽ ڪاربوڪسيليسس (PCx) ۽ ٻين عنصرن کي مضبوطيءَ سان متاثر ڪري ٿو جيڪي اينزائمز جي اظهار ۾ PNs جي آرٽيروسڪليروسس ۾ شامل آهن. هن ڳولا جي مطابقت جي تصديق ڪرڻ لاءِ، اسان خاص طور تي Mfn2-گهٽت واري PNs ۾ PCx جي اظهار کي گهٽايو، ۽ ڏٺائين ته هن آپريشن آڪسائيڊيوٽ دٻاءُ کي وڌايو ۽ نيوروڊيجنريشن کي تيز ڪيو، انهي ڪري ثابت ٿيو ته ازوسپرميا سيل جي موت کي ميٽابولڪ موافقت ڏئي ٿو. MFN2 جو سخت اظهار ٽرمينل ڊيجنريشن PN کي مڪمل طور تي بچائي سگهي ٿو سخت OXPHOS جي گهٽتائي، مائيٽوڪونڊريل ڊي اين اي جي وڏي استعمال، ۽ ظاهري طور تي ٽٽل مائيٽوڪونڊريل نيٽ ورڪ سان، جيڪو وڌيڪ زور ڏئي ٿو ته نيوروڊيجنريشن جو هي روپ سيل جي موت کان اڳ بيماري جي ترقي يافته مرحلي ۾ به بحال ٿي سگهي ٿو.
Mfn2 ناڪ آئوٽ PNs ۾ مائيٽوڪونڊريا کي ڏسڻ لاءِ، اسان هڪ مائوس اسٽرين استعمال ڪيو جيڪو ڪري تي منحصر مائيٽوڪونڊريا کي پيلي فلوروسينٽ پروٽين (YFP) (mtYFP) (20) ڪري اظهار کي نشانو بڻائڻ جي اجازت ڏئي ٿو ۽ ويوو ۾ مائيٽوڪونڊريا مورفولوجي جي جانچ ڪئي. اسان ڏٺو ته PNs ۾ Mfn2 جين جي تباهي مائيٽوڪونڊريا نيٽ ورڪ (شڪل S1A) جي بتدريج تقسيم جو سبب بڻجندي، ۽ ابتدائي تبديلي 3 هفتن جي عمر ۾ ملي. ان جي ابتڙ، PN سيل پرت جو اهم زوال، جيئن ته Calbindin immunostaining جي نقصان جو ثبوت آهي، 12 هفتن جي عمر تائين شروع نه ٿيو (شڪل 1، A ۽ B). مائيٽوڪونڊريا مورفولوجي ۾ ابتدائي تبديلين ۽ نيورونل موت جي نظر ايندڙ شروعات جي وچ ۾ وقت جي بي ترتيبي اسان کي سيل جي موت کان اڳ مائيٽوڪونڊريا جي خرابي جي ڪري ٿيندڙ ميٽابولڪ تبديلين جي جاچ ڪرڻ لاءِ چيو. اسان هڪ فلوروسينس ايڪٽيويٽيڊ سيل سورٽنگ (FACS) تي ٻڌل حڪمت عملي تيار ڪئي ته جيئن YFP (YFP+)-ايڪسپريسنگ PN (شڪل 1C) کي الڳ ڪري سگهجي، ۽ ڪنٽرول چوٿين ۾ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre)، جنهن کي بعد ۾ CTRL (شڪل S1B) سڏيو ويندو. YFP سگنل جي نسبتي شدت جي بنياد تي گيٽنگ حڪمت عملي جي اصلاح اسان کي PNs جي YFP+ باڊي (YFPhigh) کي غير PNs (YFPneg) (شڪل S1B) يا پوٽيٽو فلوروسينٽ ايڪسون/ڊينڊريٽڪ ٽڪرن (YFPlow؛ شڪل S1D، کاٻي) کان پاڪ ڪري سگهجي، جيڪو ڪنفوڪل مائڪروسڪوپ (شڪل S1D، ساڄي) ذريعي تصديق ٿيل آهي. درجه بندي ٿيل آبادي جي سڃاڻپ جي تصديق ڪرڻ لاءِ، اسان LFQ پروٽومڪس ۽ پوءِ پرنسپل جزو تجزيو ڪيو، ۽ ڏٺو ته YFPhigh ۽ YFPneg سيلز (شڪل S1C) جي وچ ۾ هڪ واضح علحدگي آهي. YFPhigh سيلز ڄاتل سڃاتل PNs مارڪرز (يعني Calb1، Pcp2، Grid2 ۽ Itpr3) (21، 22) جي خالص افزودگي ڏيکاري، پر پروٽين جي افزودگي عام طور تي نيورون يا ٻين سيل قسمن ۾ ظاهر نه ڪئي وئي (شڪل 1D). آزاد تجربن ۾ گڏ ڪيل درجه بندي YFPhigh سيلز ۾ نمونن جي وچ ۾ هڪ مقابلو هڪ باهمي تعلق جي کوٽ> 0.9 ڏيکاريو، حياتياتي نقلن جي وچ ۾ سٺي پيداوار جي صلاحيت جو مظاهرو ڪيو (شڪل S1E). خلاصو، انهن ڊيٽا ممڪن PN جي تيز ۽ مخصوص اڪيلائي لاءِ اسان جي منصوبي جي تصديق ڪئي. ڇاڪاڻ ته استعمال ٿيل L7-cre ڊرائيور سسٽم پهچائڻ کان پوءِ پهرين هفتي ۾ موزيڪ ري ڪمبينيشن کي متاثر ڪري ٿو (23)، اسان CTRL ۽ مشروط (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) نيورون گڏ ڪرڻ کان چوٿين کي ڪڍڻ شروع ڪيو. ٻيهر ڪمبينيشن مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، ان کي 4 هفتن جي عمر ۾ Mfn2cKO سڏيو ويندو آهي. آخري نقطي جي طور تي، اسان 8 هفتن جي عمر کي چونڊيو جڏهن PN پرت واضح mitochondrial ٽڪراءَ جي باوجود برقرار هئي (شڪل 1B ۽ شڪل S1A). مجموعي طور تي، اسان ڪل 3013 پروٽينن جي مقدار مقرر ڪئي، جن مان تقريبن 22٪ MitoCarta 2.0 تشريح تي ٻڌل هئا جيڪي mitochondrial پروٽوم جي بنياد تي mitochondrial (شڪل 1E) (شڪل 1E) (24) تي ٻڌل هئا. هفتي 8 تي ڪيل ڊفرنشل جين ايڪسپريشن تجزيي مان ظاهر ٿيو ته سڀني پروٽينن مان صرف 10.5٪ ۾ اهم تبديليون هيون (شڪل 1F ۽ شڪل S1F)، جن مان 195 پروٽين هيٺ منظم هئا ۽ 120 پروٽين مٿي منظم هئا (شڪل 1F). اهو قابل ذڪر آهي ته هن ڊيٽا سيٽ جو "جديد رستي جو تجزيو" ڏيکاري ٿو ته ڊفرنشل طور تي ظاهر ڪيل جين بنيادي طور تي مخصوص ميٽابولڪ رستن جي هڪ محدود سيٽ سان تعلق رکن ٿا (شڪل 1G). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، جيتوڻيڪ OXPHOS ۽ ڪيلشيم سگنلنگ سان لاڳاپيل رستن جي گهٽتائي فيوزن جي گهٽتائي واري PNs ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي شموليت جي تصديق ڪري ٿي، ٻيون ڪيٽيگريز جيڪي بنيادي طور تي امينو ايسڊ ميٽابولزم کي شامل ڪن ٿيون، خاص طور تي اپ ريگيوليشن ٿيل آهن، جيڪو ميٽابولزم سان مطابقت رکي ٿو جيڪو مائيٽوڪونڊريل PNs ۾ ٿئي ٿو. ريوائرنگ مسلسل خرابي آهي.
(الف) CTRL ۽ Mfn2cKO چوٿين جي سيريبيلر حصن جون نمائندي ڪنفوڪل تصويرون جيڪي PNs (ڪيلبائنڊن، گرين) جي ترقي پسند نقصان کي ڏيکارين ٿيون؛ نيوڪلئي کي DAPI سان جواب ڏنو ويو. (ب) (الف) جي مقدار (تغير جو هڪ طرفو تجزيو، ***P<0.001؛ n = ٽن چوٿين مان 4 کان 6 دائرا). (ج) تجرباتي ڪم جو وهڪرو. (د) پورڪنجي (مٿي) ۽ ٻين سيل قسمن (وچ) لاءِ مخصوص مارڪرز جي گرمي نقشي جي ورڇ. (اي) وين ڊاگرام جيڪو درجه بندي ٿيل PN ۾ سڃاڻپ ڪيل مائيٽوڪونڊريل پروٽين جو تعداد ڏيکاري ٿو. (ف) 8 هفتن تي Mfn2cKO نيورون ۾ مختلف طور تي ظاهر ڪيل پروٽين جو آتش فشاني پلاٽ (1.3 جي اهميت ڪٽ آف قدر). (ج) تخليقي رستي جو تجزيو 8 هفتن جي طور تي درجه بندي ڪيل Mfn2cKO PN ۾ پنج سڀ کان اهم اپ-ريگيشن (ڳاڙهو) ۽ هيٺ-ريگيشن (نيرو) رستا ڏيکاري ٿو. هر دريافت ڪيل پروٽين جي سراسري اظهار جي سطح ڏيکاري وئي آهي. گري اسڪيل گرمي جو نقشو: ترتيب ڏنل P قدر. ns، اهم نه آهي.
پروٽومڪس ڊيٽا ڏيکاريو ته ڪمپليڪس I، III، ۽ IV جي پروٽين جي اظهار ۾ بتدريج گهٽتائي آئي. ڪمپليڪس I، III، ۽ IV سڀني ۾ ضروري mtDNA-انڪوڊ ٿيل سب يونٽ شامل هئا، جڏهن ته ڪمپليڪس II، جيڪو صرف نيوڪليئر-ڪوڊ ٿيل هو، بنيادي طور تي متاثر نه ٿيو (شڪل 2A ۽ شڪل S2A). پروٽومڪس جي نتيجن سان مطابقت، سيريبيلر ٽشو سيڪشن جي امونوهسٽو ڪيمسٽري ڏيکاري ٿي ته PN ۾ ڪمپليڪس IV جي MTCO1 (مائيٽوڪونڊريل سائٽوڪروم سي آڪسائيڊس سب يونٽ 1) سب يونٽ ليول بتدريج گهٽجي وئي (شڪل 2B). mtDNA-انڪوڊ ٿيل سب يونٽ Mtatp8 کي خاص طور تي گهٽايو ويو (شڪل S2A)، جڏهن ته نيوڪليئر-انڪوڊ ٿيل ATP سنٿيس سب يونٽ جي مستحڪم-اسٽيٽ ليول ۾ ڪا تبديلي نه رهي، جيڪا سڃاتل مستحڪم ATP سنٿيس سب اسيمبلي F1 ڪمپليڪس سان مطابقت رکي ٿي جڏهن mtDNA اظهار مستحڪم آهي. ٺهڻ مسلسل آهي. مداخلت (7). ريئل ٽائيم پوليمريز چين ري ايڪشن (qPCR) ذريعي ترتيب ڏنل Mfn2cKO PNs ۾ mtDNA ليول جي تشخيص mtDNA ڪاپي نمبر ۾ بتدريج گهٽتائي جي تصديق ڪئي. ڪنٽرول گروپ جي مقابلي ۾، 8 هفتن جي عمر ۾، mtDNA ليول جو صرف 20٪ برقرار رکيو ويو (شڪل 2C). انهن نتيجن سان مطابقت رکندڙ، Mfn2cKO PNs جي ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي اسٽيننگ کي ڊي اين اي کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، جيڪو مائيٽوڪونڊريل نيوڪليوٽائڊس جي وقت تي منحصر استعمال کي ڏيکاري ٿو (شڪل 2D). اسان ڏٺو ته صرف ڪجهه اميدوار جيڪي مائيٽوڪونڊريل پروٽين جي خرابي ۽ دٻاءُ جي ردعمل ۾ شامل هئا انهن کي اپ-ريگوليٽ ڪيو ويو، جن ۾ Lonp1، Afg3l2 ۽ Clpx، ۽ OXPHOS پيچيده اسيمبلي عنصر شامل آهن. اپوپٽوسس ۾ شامل پروٽين جي سطحن ۾ ڪا به اهم تبديلي نه ملي (شڪل S2B). ساڳئي طرح، اسان ڏٺو ته ڪلسيم ٽرانسپورٽ ۾ شامل مائيٽوڪونڊريا ۽ اينڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم چينلز ۾ صرف معمولي تبديليون آهن (شڪل S2C). ان کان علاوه، آٽوفيگي سان لاڳاپيل پروٽين جي تشخيص ۾ ڪا به اهم تبديلي نه ملي، جيڪا امونوهسٽو ڪيمسٽري ۽ اليڪٽران مائڪروسڪوپي (شڪل S3) پاران وييو ۾ مشاهدو ڪيل آٽوفيگوسومز جي نظر ايندڙ انڊڪشن سان مطابقت رکي ٿي. بهرحال، PNs ۾ ترقي پسند OXPHOS dysfunction واضح الٽرا اسٽرڪچرل مائيٽوڪونڊريل تبديلين سان گڏ آهي. 5 ۽ 8 هفتن جي عمر وارن Mfn2cKO PNs جي سيل باڊيز ۽ ڊينڊريٽڪ وڻن ۾ Mitochondrial ڪلسٽر ڏسي سگهجن ٿا، ۽ اندروني جھلي جي جوڙجڪ ۾ وڏيون تبديليون آيون آهن (شڪل S4، A ۽ B). انهن الٽرا اسٽرڪچرل تبديلين ۽ mtDNA ۾ هڪ اهم گهٽتائي سان مطابقت، ٽيٽرا ميٿيل روڊامائن ميٿيل ايسٽر (TMRM) سان تيز دماغي سيريبيلر سلائسن جي تجزيي مان ظاهر ٿيو ته Mfn2cKO PNs ۾ mitochondrial جھلي جي صلاحيت ۾ خاص طور تي گهٽتائي آئي هئي (شڪل S4C).
(الف) OXPHOS ڪمپليڪس جي اظهار جي سطح جو ٽائيم ڪورس تجزيو. صرف 8 هفتن ۾ P<0.05 سان پروٽين تي غور ڪريو (ٻه طرفي ANOVA). ڊاٽ ٿيل لائن: CTRL جي مقابلي ۾ ڪا به ترتيب نه آهي. (ب) کاٻي: اينٽي-MTCO1 اينٽي باڊي (اسڪيل بار، 20 μm) سان ليبل ٿيل هڪ سيريبيلر سيڪشن جو هڪ مثال. پورڪينج سيل باڊيز پاران قبضو ڪيل علائقو پيلي سان ڍڪيل آهي. ساڄي: MTCO1 ليولز جي مقدار (ويرينس جو هڪ طرفي تجزيو؛ n = 7 کان 20 سيلز ٽن چوٿين مان تجزيو ڪيو ويو). (ج) ترتيب ڏنل PN ۾ mtDNA ڪاپي نمبر جو qPCR تجزيو (ويرينس جو هڪ طرفي تجزيو؛ n = 3 کان 7 چوٿين). (د) کاٻي: اينٽي-DNA اينٽي باڊي (اسڪيل بار، 20 μm) سان ليبل ٿيل هڪ سيريبيلر سلائس جو هڪ مثال. پورڪينج سيل باڊيز پاران قبضو ڪيل علائقو پيلي سان ڍڪيل آهي. ساڄي پاسي: mtDNA زخمن جي مقدار (تغير جو هڪ طرفو تجزيو؛ ٽن چوٿين مان n = 5 کان 9 سيلز). (E) هڪ ايڪيوٽ سيريبيلر سيڪشن جو هڪ مثال جيڪو هڪ پوري سيل پيچ ڪلمپ رڪارڊنگ ۾ mitoYFP + Purkinje سيلز (تير) ڏيکاري ٿو. (F) IV وکر جو مقدار. (G) CTRL ۽ Mfn2cKO Purkinje سيلز ۾ ڊيپولرائيزنگ ڪرنٽ انجيڪشن جي نمائندگي ڪندڙ رڪارڊنگ. مٿيون نشان: پهرين نبض جيڪا AP کي متحرڪ ڪري ٿي. هيٺيون نشان: وڌ ۾ وڌ AP فريڪوئنسي. (H) پوسٽ سينيپٽڪ اسپونٽينس ان پٽس (sPSPs) جي مقدار. نمائندو رڪارڊنگ ٽريس ۽ ان جو زوم تناسب (I) ۾ ڏيکاريل آهي. ٽن چوٿين مان n = 5 کان 20 سيلز جو تجزيو ڪيل ويرينس جو هڪ طرفو تجزيو. ڊيٽا کي اوسط ± SEM طور ظاهر ڪيو ويو آهي؛ *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) سوراخ ٿيل پيچ ڪلمپ موڊ استعمال ڪندي رڪارڊ ڪيل خود بخود AP جا نمائندا نشان. مٿيون نشان: وڌ ۾ وڌ AP فريڪوئنسي. هيٺيون نشان: هڪ واحد AP جو زوم. (K) (J) جي مطابق سراسري ۽ وڌ ۾ وڌ AP فريڪوئنسي جو مقدار مقرر ڪريو. مان-وٽني ٽيسٽ؛ n = 5 سيلز جو تجزيو چار چوٿين مان ڪيو ويو. ڊيٽا کي اوسط ± SEM طور ظاهر ڪيو ويو آهي؛ اهم نه آهي.
8 هفتن جي عمر واري Mfn2cKO PN ۾ واضح OXPHOS نقصان جو پتو لڳايو ويو، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته نيورون جو جسماني ڪم سخت غير معمولي آهي. تنهن ڪري، اسان 4 کان 5 هفتن ۽ 7 کان 8 هفتن ۾ OXPHOS-گهٽت واري نيورون جي غير فعال برقي خاصيتن جو تجزيو ڪيو ايڪيوٽ سيريبيلر سلائسز ۾ پوري سيل پيچ ڪلمپ رڪارڊنگ ڪندي (شڪل 2E). غير متوقع طور تي، Mfn2cKO نيورون جي سراسري آرام واري جھلي جي صلاحيت ۽ ان پٽ مزاحمت ڪنٽرول سان ملندڙ جلندڙ هئي، جيتوڻيڪ سيلز جي وچ ۾ معمولي فرق هئا (ٽيبل 1). ساڳئي طرح، 4 کان 5 هفتن جي عمر ۾، موجوده-وولٽيج رشتي (IV وکر) ۾ ڪا به اهم تبديلي نه ملي (شڪل 2F). جڏهن ته، 7 کان 8 هفتن جي عمر وارو ڪو به Mfn2cKO نيورون IV ريگيمن (هائپرپولرائيزيشن قدم) کان بچي نه سگهيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته هن دير واري مرحلي تي هائپرپولرائيزيشن صلاحيت لاءِ واضح حساسيت آهي. ان جي ابتڙ، Mfn2cKO نيورونز ۾، ڊيپولرائيزنگ ڪرنٽ جيڪي بار بار ٿيندڙ عمل جي صلاحيت (AP) خارج ٿيڻ جو سبب بڻجن ٿا، انهن کي چڱي طرح برداشت ڪيو ويندو آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته انهن جا مجموعي خارج ٿيڻ جا نمونا 8 هفتن جي پراڻي ڪنٽرول نيورونز کان خاص طور تي مختلف نه آهن (ٽيبل 1 ۽ شڪل 2G). ساڳئي طرح، خود بخود پوسٽ سينيپٽڪ ڪرنٽ (sPSCs) جي فريڪوئنسي ۽ ايمپليٽيوڊ ڪنٽرول گروپ جي انهن جي مقابلي ۾ هئا، ۽ واقعن جي فريڪوئنسي 4 هفتن کان 5 هفتن کان 7 هفتن کان 8 هفتن تائين ساڳئي واڌ سان وڌي وئي (شڪل 2، H ۽ I). PNs ۾ synaptic پختگي جو عرصو (25). سوراخ ٿيل PNs پيچ کان پوءِ ساڳيا نتيجا حاصل ڪيا ويا. هي ترتيب سيلولر ATP خرابين جي ممڪن معاوضي کي روڪي ٿي، جيئن پوري سيل پيچ ڪلمپ رڪارڊنگ ۾ ٿي سگهي ٿي. خاص طور تي، Mfn2cKO نيورونز جي آرام واري جھلي جي صلاحيت ۽ خود بخود فائرنگ جي فريڪوئنسي متاثر نه ٿي (شڪل 2، J ۽ K). خلاصو، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته واضح OXPHOS dysfunction سان PNs ​​اعليٰ فريڪوئنسي ڊسچارج نمونن کي چڱي طرح سان منهن ڏئي سگهن ٿا، اهو ظاهر ڪري ٿو ته هڪ معاوضي جو طريقو آهي جيڪو انهن کي عام اليڪٽرروفيزيولوجيڪل ردعمل کي برقرار رکڻ جي اجازت ڏئي ٿو.
ڊيٽا کي سراسري ± SEM طور ظاهر ڪيو ويو آهي (تغير جو هڪ طرفو تجزيو، هولم-سڊڪ جو گھڻن مقابلي وارو امتحان؛ *P<0.05). يونٽ نمبر بریکٹس سان ظاهر ڪيو ويو آهي.
اسان اهو جاچڻ لاءِ نڪتا آهيون ته ڇا پروٽومڪس ڊيٽاسيٽ (شڪل 1G) ۾ ڪنهن به ڪيٽيگري ۾ اهڙا رستا شامل آهن جيڪي سخت OXPHOS جي گهٽتائي کي منهن ڏئي سگهن ٿا، انهي ڪري وضاحت ڪئي وئي ته متاثر ٿيل PN ڇو عام اليڪٽرو فزيولوجي کي برقرار رکي سگهي ٿو (شڪل 2، E کان K). پروٽومڪس تجزيي مان ظاهر ٿيو ته برانچڊ چين امينو ايسڊز (BCAA) جي ڪيٽابولزم ۾ شامل اينزائمز خاص طور تي اپ-ريگوليٽڊ هئا (شڪل 3A ۽ شڪل S5A)، ۽ آخري پراڊڪٽ ايسٽيل-CoA (CoA) يا succinyl CoA آرٽيروسڪليروسس ايسڊ (TCA) چڪر ۾ ٽرائي ڪاربوڪسيليٽس کي پورو ڪري سگهي ٿو. اسان ڏٺو ته BCAA ٽرانسامينيز 1 (BCAT1) ۽ BCAT2 ٻنهي جو مواد وڌي ويو آهي. اهي α-ڪيٽوگلوٽاريٽ (26) مان گلوٽاميٽ پيدا ڪندي BCAA ڪيٽابولزم جي پهرين مرحلي کي ڪيٽيلائيز ڪن ٿا. سڀئي سب يونٽ جيڪي برانچڊ چين ڪيٽو ايسڊ ڊيهائيڊروجنيز (BCKD) ڪمپليڪس ٺاهيندا آهن اهي اپريگيولڊ آهن (ڪمپليڪس نتيجي ۾ BCAA ڪاربن اسڪيلٽن جي بعد ۾ ۽ ناقابل واپسي ڊيڪاربوڪسيليشن کي ڪيٽيلائيز ڪري ٿو) (شڪل 3A ۽ شڪل S5A). جڏهن ته، ترتيب ڏنل PN ۾ BCAA ۾ ڪا به واضح تبديلي نه ملي، جيڪا شايد انهن ضروري امينو ايسڊز جي سيلولر اپٽيڪ ۾ واڌ يا TCA چڪر (شڪل S5B) کي پورو ڪرڻ لاءِ ٻين ذريعن (گلوڪوز يا ليڪٽڪ ايسڊ) جي استعمال جي ڪري هجي. OXPHOS جي کوٽ واري PNs ۾ 8 هفتن جي عمر ۾ گلوٽامائن جي خراب ٿيڻ ۽ ٽرانسامينيشن جي سرگرمين ۾ اضافو پڻ ڏيکاريو ويو، جيڪو مائيٽوڪونڊريل اينزائمز گلوٽامائنيز (GLS) ۽ گلوٽامائن پائروويٽ ٽرانسامينيز 2 (GPT2) جي اپ-ريگوليشن ذريعي ظاهر ٿي سگهي ٿو (شڪل 3، A ۽ C). اهو قابل ذڪر آهي ته GLS جو اپ-ريگوليشن اسپلائسڊ آئسوفارم گلوٽامنيس سي (GLS-GAC) تائين محدود آهي (Mfn2cKO/CTRL جي تبديلي تقريبن 4.5-گنا آهي، P = 0.05)، ۽ ڪينسر جي ٽشوز ۾ ان جو مخصوص اپ-ريگوليشن مائيٽوڪونڊريل بايو انرجي کي سپورٽ ڪري سگهي ٿو. (27).
(الف) گرمي جو نقشو 8 هفتن ۾ مخصوص رستي لاءِ پروٽين جي سطح ۾ فولڊ تبديلي ڏيکاري ٿو. (ب) اينٽي پي سي ايڪس اينٽي باڊي (اسڪيل بار، 20 μm) سان ليبل ٿيل سيريبيلر سلائس جو مثال. پيلو تير پورڪينج سيل باڊي ڏانهن اشارو ڪري ٿو. (سي) ايٿيروسکلروسس لاءِ هڪ اهم اميدوار جي طور تي سڃاڻپ ٿيل ٽائيم ڪورس پروٽين ايڪسپريشن تجزيو (گهڻن ٽي ٽيسٽ، *FDR <5%؛ n = 3-5 چوٿون). (ڊي) مٿي: هڪ اسڪيميٽڪ ڊاگرام جيڪو [1-13C] پائرويٽ ٽريسر ۾ موجود ليبل ٿيل ڪاربن ۾ داخل ٿيڻ جا مختلف طريقا ڏيکاري ٿو (يعني، PDH يا ٽرانس-آرٽيريل روٽ ذريعي). هيٺيون: وائلن چارٽ [1-13C] پائرويٽ (جوڙيل ٽي ٽيسٽ؛ ** P <0.01) سان ايڪيوٽ سيريبيلر سلائسن کي ليبل ڪرڻ کان پوءِ اسپارٽڪ ايسڊ، سائٽرڪ ايسڊ ۽ ماليڪ ايسڊ ۾ تبديل ٿيل سنگل ليبل ٿيل ڪاربن (M1) جو سيڪڙو ڏيکاري ٿو. (اي) اشارو ڪيل رستي جو جامع وقت جي تاريخ جو تجزيو. صرف 8 هفتن ۾ P<0.05 سان پروٽين تي غور ڪريو. ڊيشڊ لائين: ڪابه ترتيب جي قيمت ناهي (متغير جو ٻه طرفو تجزيو؛ * P <0.05؛ *** P <0.001). ڊيٽا کي اوسط±SEM طور ظاهر ڪيو ويو آهي.
اسان جي تجزيي ۾، BCAA ڪيٽابولزم اهم اپ-ريگيوليشن رستن مان هڪ بڻجي چڪو آهي. هي حقيقت مضبوطي سان مشورو ڏئي ٿي ته TCA چڪر ۾ داخل ٿيندڙ وينٽيليشن حجم OXPHOS جي کوٽ واري PN ۾ تبديل ٿي سگهي ٿو. اهو نيورونل ميٽابولڪ ري وائرنگ جي هڪ وڏي شڪل جي نمائندگي ڪري سگهي ٿو، جيڪو شديد OXPHOS dysfunction جي سار سنڀال دوران نيورونل فزيالوجي ۽ بقا تي سڌو اثر ڪري سگهي ٿو. هن مفروضي سان مطابقت رکندڙ، اسان ڏٺو ته مکيه اينٽي-ايٿروسڪلروٽڪ اينزائم PCx اپ-ريگيولڊ آهي (Mfn2cKO/CTRL تقريبن 1.5 ڀيرا تبديل ٿئي ٿو؛ شڪل 3A)، جيڪو پائروويٽ جي آڪسالواسيٽيٽ ۾ تبديلي کي ڪيٽيلائيز ڪري ٿو (28)، جيڪو دماغ جي ٽشو ۾ اظهار کي ايسٽروسائٽس تائين محدود سمجهيو ويندو آهي (29، 30). پروٽومڪس جي نتيجن سان مطابقت رکندڙ، ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي ڏيکاريو ته PCx اظهار خاص طور تي ۽ خاص طور تي OXPHOS جي گهٽتائي واري PNs ۾ وڌيو ويو، جڏهن ته PCx رد عمل بنيادي طور تي ڪنٽرول جي ڀرسان برگمن گليل سيلز تائين محدود هو (شڪل 3B). PCx جي مشاهدي ڪيل اپ ريگيوليشن کي فعال طور تي جانچڻ لاءِ، اسان [1-13C] پائروويٽ ٽريسر سان ايڪيوٽ سيريبيلر سلائسس جو علاج ڪيو. جڏهن پائروويٽ کي پائروويٽ ڊيهائيڊروجنيز (PDH) ذريعي آڪسائيڊ ڪيو ويو، ته ان جو آئسوٽوپ ليبل غائب ٿي ويو، پر جڏهن پائروويٽ کي ويسڪولر رد عملن ذريعي ميٽابولائز ڪيو ويندو آهي ته ان کي TCA سائيڪل انٽرميڊيٽ ۾ شامل ڪيو ويندو آهي (شڪل 3D). اسان جي پروٽومڪس ڊيٽا جي حمايت ۾، اسان Mfn2cKO سلائسن جي اسپارٽڪ ايسڊ ۾ هن ٽريسر مان مارڪرن جي هڪ وڏي تعداد جو مشاهدو ڪيو، جڏهن ته سائٽرڪ ايسڊ ۽ ماليڪ ايسڊ ۾ پڻ هڪ معتدل رجحان هو، جيتوڻيڪ اهم نه هو (شڪل 3D).
MitoPark چوٿين جي ڊومامين نيورسن ۾، جيڪي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن سان گڏ آهن، خاص طور تي مائيٽوڪونڊريل ٽرانسپشن فيڪٽر A جين (Tfam) کي تباهه ڪندڙ ڊومامين نيورسن جي ڪري، PCx اظهار پڻ خاص طور تي اپ-ريگوليٽڊ هو (31)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ايسٽون ايسڊ آرٽيروسڪليروسس بيماري جي واقعن کي جسم ۾ نيورونل OXPHOS جي خرابي دوران منظم ڪيو ويندو آهي. اهو قابل ذڪر آهي ته اهو مليو آهي ته منفرد اينزائمز (32-34) جيڪي نيورونز ۾ ظاهر ٿي سگهن ٿا جيڪي آرٽيروسڪليروسس سان لاڳاپيل ٿي سگهن ٿا، OXPHOS ۾ گهٽتائي واري PNs ۾ خاص طور تي اپ-ريگوليٽڊ آهن، جهڙوڪ پروپيونيل-CoA ڪاربوڪسيلس (PCC-A)، مالونيل-CoA پروپيونيل-CoA کي succinyl-CoA ۽ mitochondrial malic enzyme 3 (ME3) ۾ تبديل ڪري ٿو، جنهن جو مکيه ڪردار ميليٽ مان پيروويٽ کي بحال ڪرڻ آهي (شڪل 3، A ۽ C) (33، 35). ان کان علاوه، اسان Pdk3 اينزائم ۾ هڪ اهم واڌارو ڏٺو، جيڪو فاسفوريليٽس ڪري ٿو ۽ ان ڪري PDH کي غير فعال ڪري ٿو (36)، جڏهن ته Pdp1 اينزائم ۾ ڪا به تبديلي نه ملي جيڪا PDH يا PDH اينزائم ڪمپليڪس کي پاڻ چالو ڪري ٿي (شڪل 3A). مسلسل، Mern2cKO PNs ۾، Ser293 ۾ PDH ڪمپليڪس جي پائروويٽ ڊيهائيڊروجنيز E1 جزو جي α1 سب يونٽ α (PDHE1α) سب يونٽ جي فاسفوريليشن (PDH جي اينزائم سرگرمي کي روڪڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو) کي وڌايو ويو (شڪل S6C) (شڪل S6C). پائروويٽ وٽ ڪا به ويسڪولر رسائي ناهي.
آخرڪار، اسان ڏٺو ته سيرين ۽ گلائسين بايو سنٿيسس جو سپر رستو، لاڳاپيل مائيٽوڪونڊريل فوليٽ (1C) چڪر ۽ پرولين بايو سنٿيسس (شڪل 1G ۽ شڪل S5C) سڀ رپورٽن جي مطابق، چالو ڪرڻ جي عمل دوران خاص طور تي اپ-ريگوليٽ ٿيل آهن. آس پاس جا ٽشوز مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن (5-7) سان چالو ٿين ٿا. انهن پروٽومڪس ڊيٽا جي حمايت ڪندڙ ڪنفوڪل تجزيو ڏيکاريو ته OXPHOS غائب هجڻ سان PN ۾، 8 هفتن جي چوٿين جي سيريبيلر سلائسس کي سيرين هائيڊروڪسي ميٿائل ٽرانسفيرس 2 (SHMT2) جي تابع ڪيو ويو، جيڪو مائيٽوڪونڊريل فوليٽ چڪر جو هڪ اهم اينزائم آهي. اهم مدافعتي ردعمل (شڪل S5D). 13 CU-گلوڪوز-انڪيوبيٽڊ ايڪيوٽ سيريبيلر سلائسس ۾، ميٽابولڪ ٽريڪنگ تجربن سيرين ۽ پرولين بايو سنٿيسس جي اپ-ريگوليشن جي وڌيڪ تصديق ڪئي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪاربان آئسوفارمز جو سيرين ۽ پرولين ۾ وهڪرو وڌي ويو (شڪل S5E). جيئن ته GLS ۽ GPT2 پاران فروغ ڏنل رد عمل گلوٽاامين مان گلوٽاميٽ جي ترکیب ۽ گلوٽاميٽ ۽ α-ڪيٽوگلوٽارٽ جي وچ ۾ ٽرانسامينيشن لاءِ ذميوار آهن، انهن جي اپ ريگيوليشن ظاهر ڪري ٿي ته OXPHOS-گهٽتائي وارا نيورون گلوٽاميٽ جي طلب ۾ اضافو ڪن ٿا، اهو شايد پرولين جي وڌندڙ بايو سنٿيسس کي برقرار رکڻ جو مقصد هجي (شڪل S5C). انهن تبديلين جي برعڪس، PN-مخصوص Mfn2cKO چوٿين مان سيريبيلر ايسٽروسائٽس جي هڪ پروٽومڪ تجزيي ڏيکاريو ته اهي رستا (سڀني اينٽي پيرو آڪسائيڊس سميت) اظهار ۾ خاص طور تي تبديل نه ٿيا، انهي ڪري اهو ظاهر ڪري ٿو ته هي ميٽابولڪ ريڊائريڪشن خراب ٿيل PN (شڪل S6، D کان G) لاءِ چونڊيل آهي.
خلاصو، انهن تجزين PNs ​​۾ مخصوص ميٽابولڪ رستن جي عارضي چالو ڪرڻ جا مختلف نمونا ظاهر ڪيا. جيتوڻيڪ غير معمولي نيورونل مائيٽوڪونڊريل فنڪشن شروعاتي ايٿيروسکلروسس ۽ 1C ريموڊلنگ (شڪل 3E ۽ شڪل S5C) جو سبب بڻجي سگهي ٿو، ۽ I ۽ IV ڪمپليڪس جي اظهار ۾ به اڳڪٿي ٿيندڙ تبديليون، سيرين ڊي نوو سنٿيسس ۾ تبديليون صرف دير سان مرحلن ۾ ظاهر ٿيون. OXPHOS dysfunction (شڪل 3E ۽ شڪل S5C). اهي نتيجا هڪ ترتيب وار عمل جي وضاحت ڪن ٿا جنهن ۾ دٻاءُ-حوصلہ افزائي مائيٽوڪونڊريل (1C چڪر) ۽ سائيٽوپلاسمڪ (سيرين بايو سنٿيسس) ٽي سي اي چڪر ۾ ايٿيروسکلروسس ۾ واڌ سان هم آهنگي سان جواب ڏين ٿا ته جيئن نيورونل ميٽابولزم کي ٻيهر شڪل ڏئي سگهجي.
8 هفتن جي عمر وارا OXPHOS جي گهٽتائي وارا PNs اعليٰ فريڪوئنسي جوش واري سرگرمي کي برقرار رکي سگهن ٿا ۽ مائيٽوڪونڊريل خرابي جي تلافي لاءِ اهم ميٽابولڪ ڪنيڪشن مان گذري سگهن ٿا. هي دريافت هڪ دلچسپ امڪان پيدا ڪري ٿي ته هن وقت به، اهي سيلز نيوروڊيجنريشن کي دير ڪرڻ يا روڪڻ لاءِ علاج جي مداخلت حاصل ڪري سگهن ٿا. دير سان. اسان هن امڪان کي ٻن آزاد مداخلتن ذريعي حل ڪيو. پهرين طريقي ۾، اسان هڪ ڪري-انحصار ايڊينو-ايسوسيئيٽڊ وائرس (AAV) ویکٹر ٺاهيو ته جيئن MFN2 کي OXPHOS جي گهٽتائي واري PNs ۾ چونڊيل طور تي ظاهر ڪري سگهجي (شڪل S7A). AAV انڪوڊنگ MFN2 ۽ فلوروسينٽ رپورٽر جين mCherry (Mfn2-AAV) کي ويٽرو ۾ پرائمري نيورون ڪلچر ۾ تصديق ڪئي وئي، جنهن سبب MFN2 کي ڪري-انحصار واري انداز ۾ ظاهر ڪيو ويو ۽ مائيٽوڪونڊريل مورفولوجي کي بچايو ويو، انهي ڪري Mfn2cKO نيورونز ۾ نيوروميوٽيشن کي روڪيو ويو (شڪل S7، B، D ۽ E). اڳيون، اسان 8 هفتن جي عمر وارن Mfn2-AAV کي Mfn2cKO ۽ ڪنٽرول چوٿين جي سيريبيلر ڪورٽيڪس تائين اسٽيريوٽيڪٽڪ طور تي پهچائڻ لاءِ ان ويوو تجربا ڪيا، ۽ 12 هفتن جي عمر وارن چوٿين جو تجزيو ڪيو (شڪل 4A). علاج ٿيل Mfn2cKO چوٿين فوت ٿي ويا (شڪل 1، A ۽ B) (16). وييو ۾ وائرل ٽرانسڊڪشن جي نتيجي ۾ ڪجهه سيريبيلر حلقن ۾ PN جي چونڊيل اظهار (شڪل S7، G ۽ H) ٿيو. صرف mCherry (Ctrl-AAV) کي ظاهر ڪندڙ ڪنٽرول AAV جي انجيڪشن جو Mfn2cKO جانورن ۾ نيوروڊيجنريشن جي درجي تي ڪو خاص اثر نه پيو. ان جي برعڪس، Mfn2-AAV سان منتقل ٿيل Mfn2cKOs جي تجزيي PN سيل پرت (شڪل 4، B ۽ C) جو هڪ اهم حفاظتي اثر ڏيکاريو. خاص طور تي، نيورون کثافت ڪنٽرول جانورن (شڪل 4، B ۽ C، ۽ شڪل S7، H ۽ I) کان تقريبن الڳ نه ٿي سگهي. MFN1 جو اظهار پر MFN2 نه، نيورونل موت کي بچائڻ ۾ برابر اثرائتو آهي (شڪل 4C ۽ شڪل S7، C ۽ F)، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته ايڪٽوپڪ MFN1 جو اظهار MFN2 جي گهٽتائي کي مؤثر طريقي سان پورو ڪري سگهي ٿو. سنگل PN سطح تي وڌيڪ تجزيو ڏيکاريو ته Mfn2-AAV وڏي پيماني تي مائيٽوڪونڊريا جي الٽرا اسٽرڪچر کي بچايو، mtDNA جي سطح کي نارمل ڪيو، ۽ اينٽي اينجيوجينيسس مارڪر PCx جي اعليٰ اظهار کي الٽ ڪيو (شڪل 4، C کان E). آرام واري حالت ۾ بچايو ويو Mfn2cKO چوٿين جو بصري معائنو ڏيکاريو ته انهن جي پوزيشن ۽ موٽر علامتون (حرڪت S1 کان S3 تائين) بهتر ٿي ويون. نتيجي ۾، اهي تجربا ڏيکارين ٿا ته OXPHOS ۾ سخت گهٽتائي سان PNs ​​۾ MFN2 جو دير سان ٻيهر تعارف mtDNA جي استعمال کي رد ڪرڻ ۽ atherosclerosis کي وڌائڻ لاءِ ڪافي آهي، ان ڪري axon degeneration ۽ neuronal death کي vivo ۾ روڪڻ لاءِ.
(الف) هڪ اسڪيم جيڪا AAV انڪوڊنگ MFN2 جي انجڪشن لاءِ تجرباتي شيڊول ڏيکاري ٿي جڏهن اشارو ڪيل ميٽابولڪ رستو چالو ٿئي ٿو. (ب) 12 هفتن جي عمر جي سيريبيلر سلائسن جون نمائندي ڪنفوڪل تصويرون 8 هفتن ۾ Mfn2cKO چوٿين ۾ منتقل ڪيون ويون ۽ اينٽي-ڪالبينڊين اينٽي باڊي سان ليبل ڪيون ويون. ساڄي: ايڪسون فائبر جي اسڪيلنگ. ايڪسون زوم جو پيمانو 450 ۽ 75 μm آهي. (سي) کاٻي: AAV ٽرانسڊڪشن لوپ (AAV+) ۾ پورڪنجي سيل کثافت جي مقدار (تغير جو هڪ طرفو تجزيو؛ n = 3 چوٿين). ساڄي: هفتي 12 تي ٽرانسڊوڊ ٿيل PN ۾ mtDNA فوڪس تجزيو (اڻ جوڙيل ٽي ٽيسٽ؛ ٽن چوٿين مان n = 6 سيلز). * P <0.05; ** P <0.01. (ڊي) Mfn2cKO سيريبيلر حصن جي PNs جا نمائندي ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروگرافس اشارو ڪيل وائرل ویکٹرز سان منتقل ڪيا ويا. گلابي ماسڪ ڊينڊرائٽس جي قبضي واري علائقي کي ظاهر ڪري ٿو، ۽ پيلو ڊاٽ ٿيل چورس ساڄي پاسي ڏنل زوم کي ظاهر ڪري ٿو؛ n نيوڪليس جي نمائندگي ڪري ٿو. اسڪيل بار، 1μm. (E) 12 هفتن تي ٽرانسڊيوس ٿيل PN ۾ PCx اسٽيننگ جو هڪ مثال ڏيکاري ٿو. اسڪيل بار، 20μm. OE، اوور ايڪسپريشن؛ FC، فولڊ تبديلي.
آخرڪار، اسان PNs ​​۾ پيرو آڪسائيڊس-حوصلہ افزائي سيل جي بقا جي اهميت جي جاچ ڪئي جن OXPHOS dysfunction جو تجربو ڪيو آهي. اسان mCherry انڪوڊنگ AAV-shRNA (شارٽ هيئر پن RNA) خاص طور تي ماؤس PCx mRNA (AAV-shPCx) کي نشانو بڻايو، ۽ وائرس يا ان جي اسڪرمبلڈ ڪنٽرول (AAV-scr) کي Mfn2cKO چوٿين جي سيريبيلم ۾ انجڪشن ڪيو. انجيڪشن عمر جي چوٿين هفتي ۾ ڪيو ويو (شڪل 5A) ان عرصي دوران مؤثر PCx ناڪ ڊائون حاصل ڪرڻ لاءِ جڏهن PCx اظهار وڌي ويو (شڪل 3C) ۽ PN سيل پرت اڃا تائين برقرار هئي (شڪل 1A). اهو قابل ذڪر آهي ته PCx کي دٻائڻ (شڪل S8A) PN موت جي هڪ اهم تيز رفتاري ڏانهن وٺي ٿو، جيڪو متاثر ٿيل انگوزي تائين محدود آهي (شڪل 5، B ۽ C). پي سي ايڪس اپ-ريگيوليشن جي ڪري پيدا ٿيندڙ ميٽابولڪ اثرات جي ميکانيزم کي سمجهڻ لاءِ، اسان پي سي ايڪس ناڪ ڊائون ۽ اي اي وي-ميڊيئيٽڊ آپٽيڪل بايوسينسر Grx1-roGFP2 جي هڪ ئي وقت ظاهر ٿيڻ کان پوءِ پي اين جي ريڊوڪس حيثيت جو مطالعو ڪيو (شڪل S8، B کان D) پيپٽائيڊ ريڊوڪس صلاحيت جي نسبتي تبديلي جو جائزو وٺڻ لاءِ گلوٽاٿيون (38). پوءِ، اسان 7 هفتن جي عمر جي Mfn2cKO يا ڪنٽرول لٽر ميٽس جي تيز دماغي سلائسن ۾ ٻه-فوٽون فلوروسينس لائف ٽائيم اميجنگ مائڪروسڪوپي (FLIM) ڪئي ته جيئن FLIM حالتن جي تصديق ڪرڻ کان پوءِ سائيٽوپلاسمڪ ريڊوڪس حيثيت ۾ امڪاني تبديلين کي ڳولي سگهجي (شڪل S8، E کان G). تجزيي ۾ هڪ واحد Mfn2cKO PN جي آڪسائيڊيشن حالت ۾ هڪ اهم اضافو ڏيکاريو ويو جنهن ۾ PCx اظهار جي کوٽ هئي، جيڪو ڪنٽرول نيورون يا Mfn2cKO PN کان مختلف آهي جيڪي صرف اسڪرمبلڈ shRNA ظاهر ڪن ٿا (شڪل 5، D ۽ E). جڏهن PCx ايڪسپريشن کي گهٽ-ضابطو ڪيو ويو، Mfn2cKO PNs جو سيڪڙو جيڪو انتهائي آڪسائيڊ ٿيل حالت ڏيکاري ٿو ٽن ڀيرا کان وڌيڪ وڌي ويو (شڪل 5E)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته PCx اپ-ضابطو خراب ٿيل نيورون جي ريڊوڪس صلاحيت کي برقرار رکيو.
(الف) هڪ اسڪيم جيڪا AAV انڪوڊنگ shPCx جي انجڪشن لاءِ تجرباتي شيڊول ڏيکاري ٿي جڏهن اشارو ڪيل ميٽابولڪ رستو چالو ٿئي ٿو. (ب) Mfn2cKO چوٿين ۾ 8 هفتن جي عمر جي سيريبيلر حصن جون نمائندي ڪنفوڪل تصويرون 4 هفتن تي اينٽي ڪيلسينورين اينٽي باڊي سان ٽرانسڊيوس ۽ ليبل ڪيون ويون. اسڪيل بار، 450μm. (سي) AAV ٽرانسڊيوسڊ لوپس ۾ پورڪنجي سيل کثافت جي مقدار (تغير جو هڪ طرفو تجزيو؛ n = 3 کان 4 چوٿين). ڊيٽا کي اوسط ± SEM طور ظاهر ڪيو ويو آهي؛ ***P<0.001. (ڊي) نمائندي FLIM تصوير مخصوص تجرباتي حالتن هيٺ 7 هفتن جي عمر جي PN جي سراسري زندگي جي مدت ڏيکاري ٿي. LUT (ڏسڻ واري ٽيبل) تناسب: بقا جو وقت وقفو (پڪو سيڪنڊن ۾). اسڪيل بار، 25μm. (E) هسٽوگرام هر حالت ۾ ٻن چوٿين ۾ (D) (n=158 کان 368 سيلز تائين) Grx1-roGFP2 لائف ٽائيم ويليوز جي ورڇ ڏيکاري ٿو. هر هسٽوگرام جي مٿان پائي چارٽ: سيلز جو تعداد ڏيکاري ٿو جن ۾ خاص طور تي ڊگهو (ڳاڙهو، آڪسائيڊ ٿيل) يا ننڍو (نيرو، گهٽ ٿيل) لائف ٽائيم ويليوز آهن، جيڪي CTRL-AAV-scr ۾ سراسري لائف ٽائيم ويليوز جي 1 SD کان وڌيڪ آهن. (F) تجويز ڪيل ماڊل نيورونل PCx جي اپ ريگيوليشن جي حفاظتي اثر کي ڏيکاري ٿو.
مجموعي طور تي، اسان هتي جيڪو ڊيٽا مهيا ڪريون ٿا اهو ڏيکاري ٿو ته MFN2 جو ٻيهر اظهار ترقي يافته PN کي مڪمل طور تي سخت OXPHOS جي گهٽتائي، سخت mtDNA جي گهٽتائي، ۽ انتهائي غير معمولي ista جهڙي مورفولوجي سان بچائي سگهي ٿو، انهي ڪري ترقي يافته بيمارين ۾ به مسلسل ترقي فراهم ڪري ٿو. نيوروڊيجنريشن سيل جي موت کان اڳ اسٽيج جو الٽڻ وارو ثبوت فراهم ڪري ٿو. ميٽابولڪ لچڪ جي هن درجي تي نيورونز جي ايٿيروسکلروسس (TCA چڪر جي ٻيهر وائرنگ) کي متاثر ڪرڻ جي صلاحيت تي وڌيڪ زور ڏنو ويو آهي، جيڪو OXPHOS جي کوٽ واري PN ۾ PCx اظهار کي روڪي ٿو ۽ سيل جي موت کي وڌائي ٿو، ان ڪري حفاظتي ڪردار ادا ڪري ٿو (شڪل 5F).
هن مطالعي ۾، اسان ثبوت فراهم ڪيا ته OXPHOS dysfunction جي خلاف PNs جو ردعمل بتدريج TCA سائيڪل atherosclerosis ۾ تبديل ٿيڻ آهي جيڪو ميٽابولڪ پروگرامن پاران چالو ڪيل فرق واري ايڪٽيويشن رستي ذريعي آهي. اسان ڪيترن ئي مڪمل طريقن سان پروٽومڪ تجزيي جي تصديق ڪئي ۽ ظاهر ڪيو ته جڏهن سخت mitochondrial dysfunction پاران چئلينج ڪيو ويندو آهي، ته نيورونز ۾ ميٽابولڪ لچڪ جي اڳ ۾ اڻڄاتل شڪل هوندي آهي. اسان جي حيرت جي ڳالهه اها آهي ته، سڄو ري وائرنگ عمل ضروري طور تي ٽرمينل ميٽابولڪ حالت کي نشانو نه بڻائيندو آهي جيڪو نيوروڊيجنريشن سان گڏ بتدريج ۽ ناقابل واپسي طور تي هوندو آهي، پر اسان جو ڊيٽا اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهو سيل جي موت کان اڳ جي مرحلي ۾ به هڪ سار سنڀال نيورون ٺاهي سگهي ٿو. فنڪشنل معاوضي جو طريقو. هي ڳولا ظاهر ڪري ٿي ته نيورونز ۾ جسم ۾ ميٽابولڪ پلاسٽيٽي جي ڪافي حد آهي. هي حقيقت ثابت ڪري ٿي ته MFN2 جو بعد ۾ ٻيهر تعارف اهم ميٽابولڪ مارڪرز جي اظهار کي رد ڪري سگهي ٿو ۽ PN جي زوال کي روڪي سگهي ٿو. ان جي برعڪس، اهو atherosclerosis کي روڪي ٿو ۽ اعصاب کي تيز ڪري ٿو. ٽرانس جنس.
اسان جي تحقيق ۾ سڀ کان وڌيڪ دلچسپ نتيجن مان هڪ اهو آهي ته OXPHOS جي کوٽ واري PNs اينزائمز کي اپ-ريگوليٽ ڪندي TCA سائيڪل ميٽابولزم کي تبديل ڪري سگهن ٿا جيڪي خاص طور تي آرٽيروسڪليروسس کي متحرڪ ڪن ٿا. ميٽابولڪ ري آرگنائيمينٽ ڪينسر سيلز جي هڪ عام خاصيت آهي، جن مان ڪجهه گلوٽاامين تي ڀروسو ڪن ٿا ته جيئن TCA سائيڪل انٽرميڊيٽ کي پورو ڪري سگهجي ته جيئن گهٽائيندڙ برابر پيدا ڪري سگهجي، جيڪي تنفس جي زنجير کي هلائيندا آهن ۽ لپڊ ۽ نيوڪليوٽائيڊ بايو سنٿيسس اڳڪٿين جي پيداوار کي برقرار رکندا آهن (39، 40). هڪ تازي مطالعي مان ظاهر ٿيو ته OXPHOS dysfunction جو تجربو ڪندڙ پردي جي ٽشوز ۾، گلوٽاامين/گلوٽاميٽ ميٽابولزم جو ٻيهر ڳنڍڻ پڻ هڪ نمايان خاصيت آهي (5، 41)، جتي TCA سائيڪل ۾ گلوٽاامين جي داخلا جي هدايت OXPHOS زخم جي شدت جي ڪري منحصر آهي (41). بهرحال، جسم ۾ نيورونل ميٽابولڪ پلاسٽيسٽي جي ڪنهن به مماثلت ۽ بيماري جي حوالي سان ان جي ممڪن مطابقت تي واضح ثبوتن جي کوٽ آهي. هڪ تازي ان ويٽرو مطالعي ۾، پرائمري ڪارٽيڪل نيورونز کي نيوروٽرانسميشن لاءِ گلوٽاميٽ پولز کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ ڏيکاريو ويو، ان ڪري ميٽابولڪ دٻاءُ جي حالتن هيٺ آڪسائيڊٽو ميٽابولزم ۽ ايٿيروسکلروسس کي فروغ ڏنو ويو (42). اهو قابل ذڪر آهي ته TCA سائيڪل اينزائم سُڪسينيٽ ڊيهائيڊروجنيز جي فارماسولوجيڪل انبيڪشن جي تحت، پائروويٽ ڪاربوڪسيليشن ڪلچرڊ سيريبيلر گرينول نيورونز ۾ آڪسالواسيٽيٽ جي ترکیب کي برقرار رکڻ لاءِ مڃيو وڃي ٿو (34). تنهن هوندي به، دماغي ٽشوز (جتي ايٿيروسکلروسس کي بنيادي طور تي ايسٽروسائٽس تائين محدود سمجهيو ويندو آهي) سان انهن ميڪانيزم جي جسماني لاڳاپي اڃا تائين اهم جسماني اهميت رکي ٿي (43). هن صورت ۾، اسان جو ڊيٽا ڏيکاري ٿو ته جسم ۾ OXPHOS پاران خراب ٿيل PNs کي BCAA ڊيگريڊريشن ۽ pyruvate ڪاربوڪسيليشن ۾ تبديل ڪري سگهجي ٿو، جيڪي TCA پول انٽرميڊيٽس جي اضافي جا ٻه مکيه ذريعا آهن. جيتوڻيڪ BCAA ڪيٽابولزم جو نيورونل توانائي ميٽابولزم ۾ پوٽيٽو حصو تجويز ڪيو ويو آهي، نيورو ٽرانسميشن لاءِ گلوٽاميٽ ۽ GABA جي ڪردار کان علاوه (44)، اڃا تائين انهن ميڪانيزم لاءِ ڪو به ثبوت ناهي. تنهن ڪري، اهو اندازو لڳائڻ آسان آهي ته غير فعال PNs خودڪار طريقي سان TCA انٽرميڊيٽس جي استعمال جي تلافي ڪري سگهن ٿا جيڪي ايٿيروسکلروسس کي وڌائيندي انضمام جي عمل ذريعي هلائي رهيا آهن. خاص طور تي، ايسپارٽڪ ايسڊ جي وڌندڙ طلب کي برقرار رکڻ لاءِ پي سي ايڪس جي اپ ريگيوليشن جي ضرورت ٿي سگھي ٿي، جيڪا مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن (45) سان وڌندڙ سيلز ۾ تجويز ڪئي وئي آهي. تنهن هوندي به، اسان جي ميٽابولومڪس تجزيي Mfn2cKO PNs (شڪل S6A) ۾ ايسپارٽڪ ايسڊ جي مستحڪم رياست جي سطح ۾ ڪا به اهم تبديلي ظاهر نه ڪئي، جيڪا ممڪن طور تي وڌندڙ سيلز ۽ پوسٽ مائيٽوٽڪ نيورون جي وچ ۾ ايسپارٽڪ ايسڊ جي مختلف ميٽابولڪ استعمال کي ظاهر ڪري ٿي. جيتوڻيڪ وييو ۾ غير فعال نيورون ۾ پي سي ايڪس اپ ريگيوليشن جو صحيح طريقو اڃا تائين بيان ڪيو ويو آهي، اسان اهو ظاهر ڪيو ته هي وقت کان اڳ ردعمل نيورون جي ريڊوڪس حالت کي برقرار رکڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو، جيڪو سيريبيلر سلائسس تي FLIM تجربن ۾ ڏيکاريو ويو هو. خاص طور تي، پي اين کي پي سي ايڪس کي اپ ريگيوليشن ڪرڻ کان روڪڻ وڌيڪ آڪسائيڊ ٿيل حالت جو سبب بڻجي سگهي ٿو ۽ سيل جي موت کي تيز ڪري سگهي ٿو. BCAA جي تباهي جي چالو ٿيڻ ۽ پائروويٽ جي ڪاربوڪسيليشن مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن جي پردي جي ٽشوز کي نمايان ڪرڻ جا طريقا نه آهن (7). تنهن ڪري، اهي OXPHOS جي گهٽتائي وارن نيورونز جي هڪ ترجيحي خاصيت نظر اچن ٿا، جيتوڻيڪ اهي واحد خاصيت نه آهن، جيڪا نيوروڊيجنريشن لاءِ اهم آهي. .
سيريبيلر بيماري هڪ غير متفاوت قسم جي نيوروڊيجينريٽو بيماري آهي جيڪا عام طور تي ايٽيڪسيا جي طور تي ظاهر ٿئي ٿي ۽ اڪثر ڪري پي اين کي نقصان پهچائيندي آهي (46). هي نيورون آبادي خاص طور تي مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن لاءِ خطرناڪ آهي ڇاڪاڻ ته چوٿين ۾ انهن جي چونڊيل انحطاط ڪيترن ئي موٽر علامتن کي ٻيهر پيدا ڪرڻ لاءِ ڪافي آهي جيڪي انساني اسپنوسيريبيلر ايٽيڪسيا جي خاصيت ڪن ٿا (16، 47، 48). رپورٽن مطابق، هڪ ٽرانسجينڪ ماؤس ماڊل هڪ ميوٽنٽ جين سان انساني اسپنوسيريبيلر ايٽيڪسيا سان لاڳاپيل آهي ۽ ان ۾ مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن (49، 50) آهي، جيڪو پي اين پي ايڇ ۾ اوڪس پي ايڇ او ايس جي گهٽتائي جي نتيجن جي مطالعي جي اهميت تي زور ڏئي ٿو. تنهن ڪري، اهو خاص طور تي هن منفرد نيورون آبادي کي مؤثر طريقي سان الڳ ڪرڻ ۽ ان جو مطالعو ڪرڻ لاءِ مناسب آهي. تاهم، ڏنو ويو آهي ته پي اين دٻاءُ لاءِ تمام حساس آهن ۽ پوري سيريبيلر سيل آبادي جو گهٽ تناسب رکن ٿا، ڪيترن ئي اومڪس تي ٻڌل مطالعي لاءِ، انهن کي پوري سيل جي طور تي چونڊيل علحدگي اڃا تائين هڪ چئلينجنگ پهلو آهي. جيتوڻيڪ ٻين سيل قسمن (خاص طور تي بالغ ٽشوز) جي آلودگي جي مڪمل کوٽ حاصل ڪرڻ تقريبن ناممڪن آهي، اسان FACS سان هڪ مؤثر الڳ ٿيڻ واري قدم کي گڏ ڪيو ته جيئن ڊائون اسٽريم پروٽومڪس تجزيي لاءِ ڪافي تعداد ۾ قابل عمل نيورون حاصل ڪري سگهجن، ۽ پوري سيريبيلم جي موجوده ڊيٽا سيٽ جي مقابلي ۾ ڪافي پروٽين ڪوريج (تقريبن 3000 پروٽين) آهي (51). پوري سيلز جي قابل عمليت کي محفوظ ڪندي، اسان هتي مهيا ڪيل طريقو اسان کي نه رڳو مائيٽوڪونڊريا ۾ ميٽابولڪ رستن ۾ تبديلين کي جانچڻ جي اجازت ڏئي ٿو، پر ان جي سائيٽوپلاسمڪ هم منصبن ۾ تبديلين کي پڻ جانچڻ جي اجازت ڏئي ٿو، جيڪو سيل جي قسم کي افزوده ڪرڻ لاءِ مائيٽوڪونڊريا جھلي ٽيگ جي استعمال کي پورو ڪري ٿو. پيچيده ٽشوز ۾ مائيٽوڪونڊريا جي تعداد لاءِ نئون طريقو (52، 53). اسان جيڪو طريقو بيان ڪريون ٿا اهو صرف پورڪنجي سيلز جي مطالعي سان لاڳاپيل ناهي، پر بيمار دماغن ۾ ميٽابولڪ تبديلين کي حل ڪرڻ لاءِ ڪنهن به قسم جي سيل تي آساني سان لاڳو ڪري سگهجي ٿو، جنهن ۾ مائيٽوڪونڊريا جي خرابي جا ٻيا ماڊل شامل آهن.
آخرڪار، اسان هن ميٽابولڪ ٻيهر ترتيب جي عمل دوران هڪ علاج واري ونڊو جي سڃاڻپ ڪئي آهي جيڪا سيلولر دٻاءُ جي اهم نشانين کي مڪمل طور تي رد ڪري سگهي ٿي ۽ نيورونل ڊيجنريشن کي روڪي سگهي ٿي. تنهن ڪري، هتي بيان ڪيل ري وائرنگ جي فنڪشنل اثرن کي سمجهڻ سان مائيٽوڪونڊريل ڊسڪشن دوران نيورونل قابليت کي برقرار رکڻ لاءِ ممڪن علاج ۾ بنيادي بصيرت مهيا ٿي سگهي ٿي. مستقبل جي تحقيق جو مقصد ٻين دماغي سيل قسمن ۾ توانائي ميٽابولزم ۾ تبديلين کي ٽوڙڻ آهي ته جيئن هن اصول جي ٻين اعصابي بيمارين تي لاڳو ٿيڻ کي مڪمل طور تي ظاهر ڪري سگهجي.
MitoPark چوٿين کي اڳ ۾ بيان ڪيو ويو آهي (31). C57BL/6N چوٿين کي loxP فلانڪنگ Mfn2 جين سان اڳ ۾ بيان ڪيو ويو آهي (18) ۽ L7-Cre چوٿين سان پار ڪيو ويو آهي (23). نتيجي ۾ ٻٽي هيٽروزيگس اولاد کي پوءِ هوموزيگس Mfn2loxP/Mfn2loxP چوٿين سان پار ڪيو ويو ته جيئن Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) لاءِ پورڪنجي مخصوص جين ناڪ آئوٽ پيدا ڪري سگهجي. ملن جي هڪ ذيلي سيٽ ۾، Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ايليل (اسٽاپ-mtYFP) کي اضافي ڪراسنگ ذريعي متعارف ڪرايو ويو (20). سڀني جانورن جي طريقيڪار کي يورپي، قومي ۽ ادارتي هدايتن جي مطابق انجام ڏنو ويو ۽ جرمني جي نارٿ رائن-ويسٽفاليا جي امويلٽ ۽ وربروچرچٽز جي لينڊيسامٽفر نيٽور پاران منظور ڪيو ويو. جانورن جو ڪم پڻ يورپي فيڊريشن آف ليبارٽري اينيمل سائنسز ايسوسيئيشن جي هدايتن تي عمل ڪري ٿو.
حاملہ عورت جي سروائيڪل ڊسڪلوڪيشن کي بي هوشي ڪرڻ کان پوءِ، مائوس جي جنين کي الڳ ڪيو ويندو آهي (E13). ڪارٽيڪس کي هينڪس جي بيلنسڊ سالٽ سوليوشن (HBSS) ۾ 10 ملي ميٽر هيپس سان گڏ ڪيو ويو ۽ ڊبلبيڪو جي موڊيفائيڊ ايگل جي ميڊيم تي منتقل ڪيو ويو جنهن ۾ پيپين (20 U/ml) ۽ سيسٽين (1μg/ml) شامل هئا. ٽشو کي DMEM ۾ انڪيوبيٽ ڪريو) ۽ ان کي اينزيميٽڪ هضم ذريعي الڳ ڪريو. Ml) 37 ° C تي 20 منٽن لاءِ، ۽ پوءِ ميڪانياتي طور تي DMEM ۾ ملائي 10٪ فيٽل بووائن سيرم سان گڏ ڪيو ويو. سيلز کي شيشي جي ڪور سلپس تي پولي لائسين سان ڍڪيل 2×106 في 6 سينٽي ميٽر ڪلچر ڊش تي يا 0.5×105 سيلز/cm2 جي کثافت تي تصويري تجزيو لاءِ ٻج ڪيو ويو. 4 ڪلاڪن کان پوءِ، ميڊيم کي نيوروبيسل سيرم فري ميڊيم سان تبديل ڪيو ويو جنهن ۾ 1٪ B27 سپليمينٽ ۽ 0.5 ملي ميٽر گلوٽا ميڪس شامل هئا. پوءِ نيورونز کي سڄي تجربي دوران 37°C ۽ 5% CO2 تي برقرار رکيو ويو، ۽ هفتي ۾ هڪ ڀيرو کارايو ويو. ان ويٽرو ۾ ٻيهر ميلاپ کي وڌائڻ لاءِ، 3μl (24-ويل ڪلچر ڊش) يا 0.5μl (24-ويل پليٽ) هيٺ ڏنل AAV9 وائرس ویکٹر جو استعمال ڪيو ويو ٻئي ڏينهن ان ويٽرو ۾ نيورونز جي علاج لاءِ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene، ڪيٽلاگ نمبر 105530-AAV9) ۽ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، ڪيٽلاگ نمبر 105545-AAV9).
ماؤس Mfn1 ۽ Mfn2 ڪمپليمينٽري ڊي اين اي (ترتيب وار ايڊجين پلازمڊ #23212 ۽ #23213 مان حاصل ڪيل) سي-ٽرمينس تي V5 سيڪوئنس (GKPIPNPLLGLDST) سان نشان لڳل آهن، ۽ T2A سيڪوئنس ذريعي فريم ۾ mCherry سان ملائي ويا آهن. Grx1-roGFP2 هيڊلبرگ ٽي پي ڊڪ DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) جو تحفو آهي. روايتي ڪلوننگ طريقن کي استعمال ڪندي tdTomato ڪيسٽ کي تبديل ڪندي، ڪيسٽ کي pAAV-CAG-FLEX-tdTomato بيڪ بون (ايڊجين ريفرنس نمبر 28306) ۾ ذيلي ڪلون ڪيو ويو ته جيئن pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5، pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ۽ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ویکٹر پيدا ڪري سگهجن. ڪنٽرول ویکٹر pAAV-CAG-FLEX-mCherry پيدا ڪرڻ لاءِ ساڳي حڪمت عملي استعمال ڪئي وئي. AAV-shPCx ڪنسٽرڪٽ پيدا ڪرڻ لاءِ، هڪ پلازمڊ AAV ویکٹر (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) جي ضرورت آهي، جنهن ۾ shRNA ٽارگيٽنگ ماؤس PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) کي انڪوڊ ڪرڻ وارو DNA تسلسل شامل آهي. U6 پروموٽر جي ڪنٽرول هيٺ، mCherry CMV پروموٽر جي ڪنٽرول هيٺ استعمال ڪيو ويندو آهي. معاون AAV ویکٹرز جي پيداوار ٺاهيندڙ جي هدايتن (سيل بايو ليبز) جي مطابق ڪئي وئي. مختصر ۾، هڪ منتقلي پلازمڊ استعمال ڪريو جيڪو mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) کي 293AAV سيلز-T2A-MFN1-V5)، mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) يا Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ڪوڊنگ جين جي منتقلي طور تي منتقلي ڪري ٿو، انهي سان گڏ AAV1 ڪيپسڊ پروٽين ۽ لوازماتي پروٽين پيڪنگنگ پلازمڊ پلازمڊ کي ڪوڊ ڪري ٿو، ڪيلشيم فاسفيٽ طريقو استعمال ڪندي. خام وائرس سپرنيٽينٽ خشڪ برف / ايٿانول غسل ۾ فريز-ٿاؤ سائيڪلن ذريعي حاصل ڪيو ويو ۽ فاسفيٽ بفر ٿيل لوڻ (PBS) ۾ سيلز کي لائيز ڪيو ويو. AAV ویکٹر کي مسلسل آئوڊڪسنول گريڊينٽ الٽرا سينٽريفيوگيشن (32,000 rpm ۽ 4°C تي 24 ڪلاڪ) ذريعي صاف ڪيو ويو ۽ هڪ اميڪن الٽرا-15 سينٽريفيوگل فلٽر استعمال ڪندي مرڪوز ڪيو ويو. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 جينوم ڪاپي (GC)/ml]، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG- FLEX جو جينوم ٽائيٽر جيئن اڳ بيان ڪيو ويو هو (54)، ريئل ٽائيم مقداري PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ۽ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ذريعي ماپيو ويو.
پرائمري نيورونز کي برف جي ٿڌي 1x ​​PBS ۾ اسڪريپ ڪيو ويو، پيليٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ 0.5٪ Triton X-100 / 0.5٪ سوڊيم ڊي آڪسيڪوليٽ / PBS ليسس بفر ۾ هڪجهڙائي ڪئي وئي جنهن ۾ فاسفيٽيس ۽ پروٽيز انبيٽر (روچ) شامل هئا. پروٽين جي مقدار کي بائيڪنچونينڪ ايسڊ ايسي (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪندي ڪيو ويو. پوءِ پروٽين کي SDS-پولياڪريلامائيڊ جيل اليڪٽروفورسس ذريعي الڳ ڪيو ويو، ۽ پوءِ پولي وينائلائيڊين فلورائيڊ جھلي (GE هيلٿ ڪيئر) تي داغ لڳايو ويو. غير مخصوص سائيٽن کي بلاڪ ڪريو ۽ TBST ۾ 5٪ کير ۾ پرائمري اينٽي باڊي (تفصيل لاءِ ٽيبل S1 ڏسو) سان انڪيوبيٽ ڪريو (ٽائيم سان ٽريس بفر ٿيل سالين)، ڌوئڻ جا مرحلا ۽ TBST انڪيوبيٽ ۾ سيڪنڊري اينٽي باڊي. +4°C تي رات جو پرائمري اينٽي باڊي سان انڪيوبيٽ ڪريو. ڌوئڻ کان پوءِ، سيڪنڊري اينٽي باڊي کي ڪمري جي حرارت تي 2 ڪلاڪن لاءِ لاڳو ڪريو. بعد ۾، ساڳئي بلٽ کي اينٽي-β-ايڪٽين اينٽي باڊي سان انڪيوبيٽ ڪندي، ساڳئي لوڊنگ جي تصديق ڪئي وئي. ڪيميلومينسنس ۾ تبديل ڪرڻ ۽ ڪيميلومينسنس کي وڌائڻ (GE هيلٿ ڪيئر) ذريعي سڃاڻپ.
شيشي جي ڪور سلپس تي اڳ ۾ ٻج ٿيل نيورونز کي 4٪ پيرافارملڊيهائيڊ (PFA)/PBS سان مخصوص وقت تي ڪمري جي حرارت تي 10 منٽن لاءِ مقرر ڪيو ويو هو. ڪور سلپس کي پهريان 0.1٪ ٽرائٽن X-100/PBS سان ڪمري جي حرارت تي 5 منٽن لاءِ، ۽ پوءِ بلاڪنگ بفر ۾ [3٪ بووائن سيرم البومين (BSA)/PBS]. ٻئي ڏينهن، ڪور سلپس کي بلاڪنگ بفر سان ڌوئي ڇڏيو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي 2 ڪلاڪن لاءِ مناسب فلوروفور-ڪنجوگيٽڊ سيڪنڊري اينٽي باڊي سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو؛ آخرڪار، نمونن کي PBS ۾ 4′، 6-diamidino-2 سان چڱي طرح ڌوئي ڇڏيو ويو -Phenylindole (DAPI) کي ڪائونٽر اسٽين ڪيو ويو ۽ پوءِ مائڪروسڪوپ سلائيڊ تي Aqua-Poly/Mount سان فڪس ڪيو ويو.
چوٿين (نر ۽ مادي) کي ڪيٽامائن (130 ملي گرام/ڪلوگرام) ۽ زائلازائن (10 ملي گرام/ڪلوگرام) جي انٽراپيريٽونيل انجيڪشن ذريعي بي هوشي ڪئي وئي ۽ ڪارپروفين اينالجيسڪ (5 ملي گرام/ڪلوگرام) سان چمڙي جي هيٺان ڏني وئي، ۽ هڪ اسٽيريوٽيڪٽڪ اوزار (ڪوپف) ۾ رکيو ويو جيڪو گرم پيڊ سان ليس هو. کوپڙي کي ظاهر ڪريو ۽ مس هڏن سان لاڳاپيل سيريبيلر ڪارٽيڪس جي حصي کي پتلي ڪرڻ لاءِ ڏندن جي ڊرل استعمال ڪريو (ليمبڊا کان: دم 1.8، ليٽرل 1، لوبيول IV ۽ V سان لاڳاپيل). هيٺان ويسڪوليچر کي خراب ڪرڻ کان بچڻ لاءِ احتياط سان کوپڙي ۾ هڪ ننڍڙو سوراخ ٺاهڻ لاءِ هڪ وکر سرنج سوئي استعمال ڪريو. پوءِ پتلي ٺهيل شيشي جي ڪيپيلري کي آهستي آهستي مائڪرو هول ۾ داخل ڪيو ويندو آهي (ڊورا ميٽر جي وينٽرل پاسي تي -1.3 کان -1 تائين)، ۽ 200 کان 300 اين ايل AAV کي دستي سرنج (ناريشيج) سان مائڪرو انجيڪٽر (ناريشيج) ۾ ڪيترائي ڀيرا گهٽ دٻاءُ تي 10 کان 20 منٽن جي ونڊو ۾ داخل ڪيو ويندو آهي. انفيوژن کان پوءِ، ڪيپيلري کي ٻئي 10 منٽن لاءِ رکو ته جيئن وائرس مڪمل طور تي پکڙجي سگهي. ڪيپيلري کي ڪڍڻ کان پوءِ، چمڙي کي احتياط سان سلائي ڪيو ويندو آهي ته جيئن زخم جي سوزش کي گهٽائي سگهجي ۽ جانور کي بحال ٿيڻ جي اجازت ڏني وڃي. آپريشن کان پوءِ ڪيترن ئي ڏينهن تائين جانورن جو علاج اينالجيسڪس (ڪيسپوفين) سان ڪيو ويو، جنهن دوران انهن جي جسماني حالت کي احتياط سان مانيٽر ڪيو ويو ۽ پوءِ انهن کي بيان ڪيل وقت تي ايٿانائيز ڪيو ويو. سڀئي طريقا يورپي، قومي ۽ ادارتي هدايتن جي مطابق ڪيا ويا ۽ جرمني جي نارٿ رائن-ويسٽفاليا جي امويلٽ ۽ وربروچرچٽز جي لينڊيسامٽفر نيٽور پاران منظور ڪيا ويا.
جانورن کي ڪيٽامائن (100 ملي گرام/ڪلوگرام) ۽ زائلازائن (10 ملي گرام/ڪلوگرام) سان بي هوشي ڪئي وئي، ۽ دل کي پهريان 0.1 ايم پي بي ايس سان پرفيوز ڪيو ويو، ۽ پوءِ پي بي ايس ۾ 4٪ پي ايف اي سان. ٽشو کي ڪٽيو ويو ۽ رات جو 4٪ پي ايف اي/پي بي ايس ۾ 4 ° سي تي مقرر ڪيو ويو. هڪ وائبريٽنگ چاقو (لائيڪا مائڪرو سسٽم GmbH، ويانا، آسٽريا) پي بي ايس ۾ مقرر دماغ مان ساگيٽل سيڪشن (50 μm ٿلهو) تيار ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو هجي، فري فلوٽنگ سيڪشنز جي اسٽيننگ مٿي بيان ڪيل طريقي سان ڪئي وئي (13) ڪمري جي حرارت تي ۽ اسٽرائنگ. مختصر ۾، پهرين، حاصل ڪيل سلائسن کي ڪمري جي حرارت تي 15 منٽن لاءِ 0.5٪ ٽرائٽن X-100/PBS سان پرميبلائيز ڪيو ويو؛ ڪجهه ايپيٽوپس (Pcx ۽ Shmt2) لاءِ، 80 ° سي (PH 9) تي ٽريس-اي ڊي ٽي اي بفر ذريعي سلائسن کي هن قدم جي بدران 25 منٽن لاءِ گرم ڪريو. ان کان پوءِ، حصن کي پرائمري اينٽي باڊي (ٽيبل S1 ڏسو) سان بلاڪنگ بفر (3٪ BSA/PBS) ۾ رات جو 4°C تي هلڪي هلڪي سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ٻئي ڏينهن، حصن کي بلاڪنگ بفر سان ڌوئي ڇڏيو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي 2 ڪلاڪن لاءِ مناسب فلوروفور-ڪنجوگيٽڊ سيڪنڊري اينٽي باڊي سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو؛ آخرڪار، حصن کي PBS ۾ چڱي طرح ڌوئي ڇڏيو ويو، DAPI سان ڪائونٽر اسٽين ڪيو ويو، ۽ پوءِ مائڪروسڪوپ سلائيڊ تي AquaPolymount سان درست ڪيو ويو.
نموني جي تصوير ڪڍڻ لاءِ هڪ ليزر اسڪيننگ ڪنفوڪل مائڪروسڪوپ (TCS SP8-X يا TCS ڊجيٽل لائيٽ شيٽ، ليڪا مائڪروسسٽمس) استعمال ڪيو ويو جيڪو هڪ اڇي روشني واري ليزر ۽ 405 ڊاءِوڊ الٽراوائليٽ ليزر سان ليس هو. فلوروفور کي متحرڪ ڪرڻ ۽ هائبرڊ ڊيٽيڪٽر (HyDs) سان سگنل گڏ ڪرڻ سان، LAS-X سافٽ ويئر کي ترتيب وار موڊ ۾ Nyquist نموني جي مطابق اسٽيڪ ٿيل تصويرون گڏ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو: غير مقداري پينلز لاءِ، اهو انتهائي متحرڪ سگنل آهن (مثال طور، سوميٽڪ سيلز ۽ ڊينڊرائيٽس ۾) mtYFP) برائيٽ آر موڊ ۾ PNs جي تعداد کي ڳولڻ لاءِ HyD استعمال ڪريو). پس منظر کي گهٽائڻ لاءِ 0.3 کان 6 ns تائين گيٽنگ لاڳو ڪئي وئي آهي.
ترتيب ڏنل سيلز جي ريئل ٽائيم تصويري. 1٪ B27 سپليمينٽ ۽ 0.5 ايم ايم گلوٽا ميڪس تي مشتمل نيوروباسال-اي ميڊيم ۾ ترتيب ڏيڻ کان پوءِ، سيلز کي فوري طور تي پولي-ايل-لائسين-ڪوٽيڊ شيشي جي سلائڊن (μ-سلائيڊ 8 ويل، آئيبيڊي، ڪيٽلاگ نمبر 80826) تي سيڊ ڪيو ويو، ۽ پوءِ ان کي 37°C ۽ 5% CO2 تي 1 ڪلاڪ لاءِ رکو ته جيئن سيلز کي آباد ٿيڻ جي اجازت ملي سگهي. ريئل ٽائيم تصويري هڪ ليڪا SP8 ليزر اسڪيننگ ڪنفوڪل مائڪروسڪوپ تي ڪئي وئي جيڪا هڪ اڇي ليزر، HyD، 63×[1.4 عددي ايپرچر (NA)] آئل آبجيڪٽو لينس ۽ هڪ هيٽنگ اسٽيج سان ليس هئي.
مائوس کي جلدي ڪاربن ڊاءِ آڪسائيڊ سان بي هوشي ڪئي وئي ۽ سر ڪٽيو ويو، دماغ کي جلدي کوپڙي مان ڪڍيو ويو، ۽ 200μm ٿلهي (13C ليبلنگ تجربي لاءِ) يا 275μm ٿلهي (ٻن فوٽون تجربن لاءِ) ساگيٽل سيڪشن ۾ ڪٽيو ويو جيڪو هيٺين مواد سان ڀريو ويو. آئس ڪريم (HM-650 V، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، والڊورف، جرمني) هيٺ ڏنل مواد سان ڀريل آهي: 125 mM برفاني ٿڌي، ڪاربن سان ڀريل (95% O2 ۽ 5% CO2) گهٽ Ca2 + مصنوعي دماغي اسپائنل فلوئڊ (ACSF) NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڊيم فاسفيٽ بفر، 25 mM NaHCO3، 25 mM گلوڪوز، 0.5 mM CaCl2 ۽ 3.5 mM MgCl2 (310 کان 330 mmol جو آسموٽڪ پريشر). حاصل ڪيل دماغي سلائسن کي هڪ پري انڪيوبيشن چيمبر ۾ منتقل ڪريو جنهن ۾ وڌيڪ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڊيم فاسفيٽ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلوڪوز، 1.0 mM CaCl2 ۽ 2.0 mM MgCl2 (ميڊيم) pH 7.4 ۽ 310 کان 320 mmol) شامل آهن.
تصوير ڪڍڻ جي عمل دوران، سلائسن کي هڪ وقف ٿيل تصوير ڪڍڻ واري ڪمري ۾ منتقل ڪيو ويو، ۽ تجربو 32° کان 33°C جي مسلسل گرمي پد تي مسلسل ACSF پرفيوژن هيٺ ڪيو ويو. هڪ ملٽي فوٽون ليزر اسڪيننگ مائڪروسڪوپ (TCS SP8 MP-OPO، Leica Microsystems) جيڪو Leica 25x آبجيڪٽو لينس (NA 0.95، پاڻي)، Ti: Sapphire ليزر (Cameleon Vision II، Coherent) سان ليس هو، سلائس تصوير ڪڍڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. FLIM ماڊيول (PicoHarp300، PicoQuant).
Grx1-roGFP2 جو FLIM. PNs جي cytoplasmic redox حالت ۾ تبديليون ساگيٽل دماغ جي سلائسن ۾ ٻن-فوٽن FLIM ذريعي ماپيون ويون، جتي Grx1-roGFP2 بايوسينسر PNs کي نشانو بڻايو. PN پرت ۾، حصول جي ميدان کي سلائس جي مٿاڇري کان 50 کان 80 μm هيٺ چونڊيو ويندو آهي انهي کي يقيني بڻائڻ لاءِ ته هڪ قابل عمل PN آهي (يعني، ڊينڊريٽس سان گڏ موتي جي جوڙجڪ يا نيورونل مورفولوجيڪل تبديلين جي کوٽ) ۽ ڊبل مثبت roGFP2 سينسر ۽ AAV انڪوڊنگ shRNA PCx يا ان جي ڪنٽرول تسلسل (هر هڪ گڏيل اظهار ڪندڙ mCherry). 2x ڊجيٽل زوم سان سنگل اسٽيڪ تصويرون گڏ ڪريو [ايجسٽيشن ويڪرائي ڦاڪ: 890 nm؛ 512 nm 512 پکسلز]. ڳولا: اندروني HyD، فلوروسين آئسوٿيوسائنٽ (FITC) فلٽر گروپ] ۽ 2 کان 3 منٽن اندر تصوير جي اوسط کي يقيني بڻائڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته ڪافي فوٽون گڏ ڪيا وڃن (مجموعي طور تي 1000 فوٽون) وکر فٽنگ لاءِ. Grx1-roGFP2 پروب جي حساسيت ۽ FLIM حالتن جي تصديق roGFP2 جي عمر جي قدر جي نگراني ڪندي ڪئي وئي جڏهن پرفيوژن ACSF ۾ خارجي 10 mM H2O2 شامل ڪيو ويو (آڪسائيڊيشن کي وڌائڻ لاءِ، نتيجي ۾ عمر ۾ اضافو)، ۽ پوءِ 2 mM dithiothreitol شامل ڪيو ويو (گهٽتائي جي درجي کي گھٽائي ٿو، نتيجي ۾ عمر ۾ گهٽتائي) (شڪل S8، D کان G). حاصل ڪيل نتيجن جو تجزيو ڪرڻ لاءِ FLIMfit 5.1.1 سافٽ ويئر استعمال ڪريو، پوري تصوير جي سنگل ايڪسپونشنل ڊيڪي وکر کي ماپيل IRF (آلات جي جواب جي فنڪشن) سان فٽ ڪريو، ۽ χ2 تقريبن 1 آهي. هڪ PN جي زندگي جي حساب ڪرڻ لاءِ، اعصاب جي جسم جي چوڌاري ماسڪ دستي طور تي ٺاهيو ويو، ۽ هر ماسڪ ۾ سراسري زندگي جي مقدار جي تصديق لاءِ استعمال ڪئي وئي.
مائٽوڪنڊريل امڪاني تجزيو. ايڪيوٽ سيڪشن کي 100 nM TMRM سان انڪيوبيٽ ڪرڻ کان پوءِ سڌو سنئون پرفيوز ٿيل ACSF ۾ 30 منٽن لاءِ شامل ڪيو ويو، PNs جي مائيٽوڪونڊريل امڪاني تبديلين کي ٻن-فوٽون مائڪروسڪوپ ذريعي ماپيو ويو. TMRM اميجنگ 920 nm تي پروب کي اتساهيندڙ ۽ سگنل گڏ ڪرڻ لاءِ اندروني HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) استعمال ڪندي ڪئي وئي؛ ساڳئي ايڪسائيٽيشن طول موج استعمال ڪندي پر mtYFP جي تصوير لاءِ هڪ مختلف اندروني HyD (FITC :525/50) استعمال ڪندي. سنگل سيل ليول تي مائيٽوڪونڊريل صلاحيت جو جائزو وٺڻ لاءِ ImageJ جي تصوير ڪيلڪيوليٽر پلگ ان استعمال ڪريو. مختصر ۾، پلگ ان مساوات: سگنل = منٽ (mtYFP، TMRM) mitochondrial علائقي کي سڃاڻڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي جيڪو لاڳاپيل چينل جي سنگل اسٽيڪ ڪنفوڪل تصوير ۾ Purkinje Somali ۾ TMRM سگنل ڏيکاري ٿو. پوءِ نتيجي ۾ نڪرندڙ ماسڪ ۾ پڪسل ايريا کي مقدار ۾ طئي ڪيو ويندو آهي، ۽ پوءِ mtYFP چينل جي لاڳاپيل حد سنگل اسٽيڪ تصوير تي نارملائيز ڪيو ويندو آهي ته جيئن مائيٽوڪونڊريل صلاحيت ڏيکاريندڙ مائيٽوڪونڊريل حصو حاصل ڪري سگهجي.
تصوير کي هائيگينس پرو (سائنٽيفڪ واليوم اميجنگ) سافٽ ويئر سان ڊي ڪنولوليٽ ڪيو ويو. ٽائلس جي اسڪين ٿيل تصويرن لاءِ، LAS-X سافٽ ويئر پاران مهيا ڪيل خودڪار سلائي الگورتھم استعمال ڪندي هڪ ٽائل جو مونٽيج ٺاهيو ويندو آهي. تصوير جي ڪيليبريشن کان پوءِ، تصوير کي وڌيڪ پروسيس ڪرڻ لاءِ ImageJ ۽ Adobe Photoshop استعمال ڪريو ۽ چمڪ ۽ برعڪس کي هڪجهڙائي سان ترتيب ڏيو. گرافڪ تياري لاءِ Adobe Illustrator استعمال ڪريو.
mtDNA فوڪس تجزيو. ڪنفوڪل مائڪروسڪوپ ذريعي ڊي اين اي جي خلاف اينٽي باڊيز سان ليبل ٿيل سيريبيلر حصن تي mtDNA زخمن جو تعداد مقدار ۾ طئي ڪيو ويو. هر سيل جي جسم ۽ هر سيل جي نيوڪليس لاءِ هر ٽارگيٽ ايريا ٺاهيو ويو، ۽ لاڳاپيل ايريا کي ملٽي ميجر پلگ ان (ImageJ سافٽ ويئر) استعمال ڪندي ڳڻيو ويو. سائيٽوپلاسمڪ ايريا حاصل ڪرڻ لاءِ سيل جي جسم جي علائقي مان نيوڪليئر ايريا کي گھٽايو. آخرڪار، اينالائيز پارٽيڪلز پلگ ان (ImageJ سافٽ ويئر) کي خودڪار طريقي سان سائيٽوپلاسمڪ ڊي اين اي پوائنٽس کي مقدار ڏيڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو جيڪو حد جي تصوير تي mtDNA کي ظاهر ڪري ٿو، ۽ حاصل ڪيل نتيجن کي CTRL چوٿين جي PN اوسط تائين نارمل ڪيو ويو. نتيجن کي في سيل نيوڪليسائيڊ جي سراسري تعداد جي طور تي ظاهر ڪيو ويو آهي.
پروٽين ايڪسپريشن تجزيو. ImageJ جي تصوير ڪيلڪيوليٽر پلگ ان کي استعمال ڪريو PN ۾ پروٽين ايڪسپريشن کي سنگل سيل ليول تي جائزو وٺڻ لاءِ. مختصر ۾، لاڳاپيل چينل جي سنگل-ليئر ڪنفوڪل تصوير ۾، مساوات ذريعي: سگنل = منٽ (mtYFP، اينٽي باڊي)، مائيٽوڪونڊريل علائقو جيڪو پورڪينا ۾ هڪ خاص اينٽي باڊي کي مدافعتي سرگرمي ڏيکاري ٿو، سڃاڻپ ڪئي وئي آهي. پوءِ نتيجي ۾ ماسڪ ۾ پکسل ايريا کي مقدار ۾ طئي ڪيو ويندو آهي، ۽ پوءِ ڏيکاريل پروٽين جي مائيٽوڪونڊريل حصو حاصل ڪرڻ لاءِ mtYFP چينل جي لاڳاپيل حد سنگل اسٽيڪ تصوير تي نارمل ڪيو ويندو آهي.
پورڪنجي سيل جي کثافت جو تجزيو. ImageJ جو سيل ڪائونٽر پلگ ان استعمال ڪيو ويو پورڪنجي کثافت جو جائزو وٺڻ لاءِ پرڪنجي سيلز جي تعداد کي ڳڻپ ٿيل سيلز پاران قبضو ڪيل سيريبيلر رنگ جي ڊيگهه سان ورهائي.
نموني جي تياري ۽ گڏ ڪرڻ. ڪنٽرول گروپ ۽ Mfn2cKO چوٿين مان دماغ 0.1 M فاسفيٽ بفر (PB) ۾ 2% PFA/2.5% گلوٽاراالڊيهائيڊ ۾ مقرر ڪيا ويا، ۽ پوءِ ڪورونل سيڪشنز کي سليئيٽس استعمال ڪندي تيار ڪيو ويو (ليڪا مائڪرو سسٽم GmbH، ويانا، آسٽريا) (ٿلهائي 50 کان 60 μm) پوءِ 1 ڪلاڪ لاءِ ڪمري جي حرارت تي 1% os tetraoxide ۽ 1.5% پوٽاشيم فيروسائنائيڊ ۾ PB بفر ۾ درست ڪيو ويو. سيڪشنز کي ٽي ڀيرا ڊسٽلڊ پاڻي سان ڌويو ويو، ۽ پوءِ 20 منٽن لاءِ 1% يورينائل ايسٽيٽ تي مشتمل 70% ايٿانول سان داغ ڏنو ويو. پوءِ سيڪشنز کي گريڊ ٿيل الڪوحل ۾ ڊيهائيڊريٽ ڪيو ويو ۽ ڊرڪوپان ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences، catalog number 14040) ۾ سلڪون ڪوٽيڊ شيشي جي سلائڊن جي وچ ۾ شامل ڪيو ويو، ۽ آخرڪار 60°C تي 48 ڪلاڪن لاءِ تندور ۾ پوليمرائز ڪيو ويو. سيريبيلر ڪارٽيڪس ايريا چونڊيو ويو ۽ ليڪا الٽرا ڪٽ (ليڪا مائڪرو سسٽم GmbH، ويانا، آسٽريا) تي 50 nm الٽرا ٿن حصن کي ڪٽيو ويو ۽ پولسٽريئر فلم سان ڍڪيل 2×1 ملي ميٽر ڪاپر سلٽ گرڊ تي چونڊيو ويو. حصن کي H2O ۾ 4٪ يورينيل ايسٽيٽ جي محلول سان 10 منٽن لاءِ داغ ڏنو ويو، H2O سان ڪيترائي ڀيرا ڌويو ويو، پوءِ رينالڊس ليڊ سائٽريٽ سان H2O ۾ 10 منٽن لاءِ، ۽ پوءِ H2O سان ڪيترائي ڀيرا ڌويو ويو. مائڪروگراف هڪ ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپ فلپس CM100 (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، والٿم، ايم اي، آمريڪا) سان هڪ TVIPS (ٽائيٽز وڊيو ۽ تصوير پروسيسنگ سسٽم) TemCam-F416 ڊجيٽل ڪئميرا (ٽيويپس GmbH، گاؤٽنگ، آمريڪا) استعمال ڪندي ورتو ويو. جرمني).
AAV سان متاثر ٿيل چوٿين لاءِ، دماغ کي الڳ ڪيو ويو ۽ 1 ملي ميٽر ٿلهي ساگيٽل سيڪشن ۾ ڪٽيو ويو، ۽ AAV سان متاثر ٿيل انگوزي (يعني mCherry ايڪسپريسنگ) جي سڃاڻپ لاءِ فلوروسينس مائڪروسڪوپ استعمال ڪندي سيريبيلم جو معائنو ڪيو ويو. صرف اهي تجربا جن ۾ AAV انجيڪشن جي نتيجي ۾ گهٽ ۾ گهٽ ٻن لڳاتار سيريبيلر انگوزي ۾ پورڪنجي سيل پرت (يعني تقريبن پوري پرت) جي تمام گهڻي ٽرانسڊڪشن ڪارڪردگي هوندي آهي استعمال ڪيا ويندا آهن. AAV-ٽرانسڊيوسڊ لوپ کي رات جو پوسٽ فڪسيشن (4٪ PFA ۽ 0.1 M ڪوڪوٽ بفر ۾ 2.5٪ گلوٽاراالڊيهائيڊ) لاءِ مائڪروڊسيڪٽ ڪيو ويو ۽ وڌيڪ پروسيس ڪيو ويو. EPON ايمبيڊنگ لاءِ، فڪسڊ ٽشو کي 0.1 M سوڊيم ڪوڪوٽ بفر (Applichem) سان ڌوئي وئي، ۽ 2٪ OsO4 (os، سائنس سروسز؛ Caco) سان 0.1 M سوڊيم ڪوڪوٽ بفر (Applichem) ۾ 4 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، پوءِ 2 ڪلاڪن لاءِ ڌوئي ڇڏيو. 0.1 M ڪوڪامائيڊ بفر سان 3 ڀيرا ورجايو. ان کان پوءِ، ايٿانول جي چڙهندڙ سيريز کي هر ايٿانول محلول کي 4°C تي 15 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو ته جيئن ٽشو کي ڊيهائيڊريٽ ڪري سگهجي. ٽشو کي پروپيلين آڪسائيڊ ۾ منتقل ڪيو ويو ۽ رات جو EPON (سگما-الڊرچ) ۾ 4°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ٽشو کي ڪمري جي حرارت تي تازي EPON ۾ 2 ڪلاڪن لاءِ رکو، ۽ پوءِ ان کي 62°C تي 72 ڪلاڪن لاءِ شامل ڪريو. 70 nm الٽراٿن حصن کي ڪٽڻ لاءِ الٽرامائڪروٽوم (لائيڪا مائڪرو سسٽم، UC6) ۽ هڪ هيرا چاقو (ڊائيٽوم، بيئل، سوئٽزرلينڊ) استعمال ڪريو، ۽ 1.5٪ يورينيل ايسٽيٽ سان 37°C تي 15 منٽن لاءِ داغ ڏيو، ۽ 4 منٽن لاءِ ليڊ سائٽريٽ محلول سان داغ ڏيو. اليڪٽران مائڪروگراف ڪيمرا ون وييو 4K 16-بٽ (گيٽن) ۽ ڊجيٽل مائڪروگراف سافٽ ويئر (گيٽن) سان ليس JEM-2100 پلس ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪروسڪوپ (JEOL) استعمال ڪندي ورتا ويا. تجزيي لاءِ، اليڪٽران مائڪروگراف 5000× يا 10,000× ڊجيٽل زوم سان حاصل ڪيا ويا.
مائيٽوڪونڊريا جو مورفولوجيڪل تجزيو. سڀني تجزين لاءِ، انفرادي مائيٽوڪونڊريا جي شڪلن کي ڊجيٽل تصويرن ۾ دستي طور تي ImageJ سافٽ ويئر استعمال ڪندي بيان ڪيو ويو. مختلف مورفولوجيڪل پيرا ميٽرز جو تجزيو ڪيو ويو آهي. مائيٽوڪونڊريا جي کثافت کي هر سيل جي ڪل مائيٽوڪونڊريا علائقي کي سائيٽوپلازم ايريا (سائٽوپلازم ايريا = سيل ايريا-سيل نيوڪليس ايريا) × 100 سان ورهائڻ سان حاصل ڪيل فيصد جي طور تي ظاهر ڪيو ويندو آهي. مائيٽوڪونڊريا جي گولائي جو حساب فارمولا [4π∙(ايريا/پريميٽر 2)] سان ڪيو ويندو آهي. مائيٽوڪونڊريا جي ايسٽا مورفولوجي جو تجزيو ڪيو ويو ۽ انهن جي مکيه شڪلن جي مطابق ٻن قسمن ("ٽيوبلر" ۽ "بلسٽر") ۾ ورهايو ويو.
آٽوفيگوسوم/لائيسوسم نمبر ۽ کثافت جو تجزيو. ڊجيٽل تصوير ۾ هر آٽوفيگوسوم/لائيسوسم جي شڪل کي دستي طور تي بيان ڪرڻ لاءِ ImageJ سافٽ ويئر استعمال ڪريو. آٽوفيگوسوم/لائيسوسم ايريا کي هر سيل جي ڪل آٽوفيگوسوم/لائيسوسم structure ايريا کي سائيٽوپلازم ايريا (سائٽوپلازم ايريا = سيل ايريا-نيوڪليس ايريا) × 100 سان ورهائي حساب ڪيل فيصد جي طور تي ظاهر ڪيو ويندو آهي. آٽوفيگوسوم/لائيسوسم جي کثافت جو حساب ڪل تعداد کي في سيل آٽوفيگوسوم/لائيسوسم structures structures جي تعداد سان ورهائي ڪيو ويندو آهي (سائٽوپلازمڪ ايريا = سيل ايريا-نيوڪليئر ايريا).
ايڪٽ سيڪشننگ ۽ نموني جي تياري لاءِ ليبلنگ. تجربن لاءِ جن کي گلوڪوز ليبلنگ جي ضرورت آهي، ايڪٽ برين سلائسز کي پري انڪيوبيشن چيمبر ۾ منتقل ڪريو، جنهن ۾ سير ٿيل ڪاربن (95٪ O2 ۽ 5٪ CO2)، هاءِ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڊيم فاسفيٽ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلوڪوز، 1.0 mM CaCl2 ۽ 2.0 mM MgCl2، pH 7.4 ۽ 310 کان 320 mOsm تائين ترتيب ڏنل آهي)، جنهن ۾ گلوڪوز 13 C 6- گلوڪوز متبادل (يوريسوٽاپ، ڪيٽلاگ نمبر CLM-1396) آهي. تجربن لاءِ جن کي پائروويٽ ليبلنگ جي ضرورت آهي، تيز دماغ جي سلائسن کي وڌيڪ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڊيم فاسفيٽ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلوڪوز، 1.0 mM CaCl2) ۾ منتقل ڪريو ۽ 2.0 mM MgCl2 شامل ڪريو، pH 7.4 ۽ 310 کي 320mOsm تائين ترتيب ڏيو)، ۽ 1 mM 1-[1-13C] پائروويٽ (يوريسوٽاپ، ڪيٽلاگ نمبر CLM-1082) شامل ڪريو. حصن کي 90 منٽن لاءِ 37°C تي انڪيوبيٽ ڪريو. تجربي جي آخر ۾، حصن کي جلدي هڪ آبي محلول (pH 7.4) سان ڌوئيو ويو جنهن ۾ 75 ملي ميٽر امونيم ڪاربونيٽ شامل هو، ۽ پوءِ 40:40:20 (v:v:v) ايسٽونائيٽرائيل (ACN): ميٿانول: پاڻي ۾ هم جنس ڪيو ويو. حصن کي 30 منٽن لاءِ برف تي انڪيوبيٽ ڪرڻ کان پوءِ، نمونن کي 4°C تي 10 منٽن لاءِ 21,000 گرام تي سينٽرفيوج ڪيو ويو، ۽ صاف سپرنيٽينٽ کي اسپيڊ ويڪ ڪنسنٽريٽر ۾ خشڪ ڪيو ويو. نتيجي ۾ خشڪ ميٽابولائٽ پيلٽ کي تجزيو تائين -80°C تي ذخيرو ڪيو ويو.
13 سي-ليبل ٿيل امينو ايسڊز جو مائع ڪروميٽوگرافي-ماس اسپيڪٽروميٽري تجزيو. مائع ڪروميٽوگرافي-ماس اسپيڪٽروميٽري (LC-MS) تجزيي لاءِ، ميٽابولائٽ پيلٽ کي 75μl LC-MS گريڊ پاڻي (هني ويل) ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو. 4°C تي 5 منٽن لاءِ 21,000 گرام تي سينٽرفيوگيشن کان پوءِ، 20 μl ڪلارڊ سپرنيٽينٽ امينو ايسڊ فلڪس تجزيي لاءِ استعمال ڪيو ويو، جڏهن ته باقي اقتباس فوري طور تي اينين ​​تجزيي لاءِ استعمال ڪيو ويو (هيٺ ڏسو). امينو ايسڊ تجزيو اڳ ۾ بيان ڪيل بينزول ڪلورائڊ ڊيريويٽيزيشن پروٽوڪول (55، 56) استعمال ڪندي ڪيو ويو. پهرين قدم ۾، 100 ايم ايم سوڊيم ڪاربونيٽ (سگما-الڊرچ) جو 10μl ميٽابولائٽ ايڪسٽريڪٽ جي 20μl ۾ شامل ڪيو ويو، ۽ پوءِ 10μl 2٪ بينزول ڪلورائڊ (سگما-الڊرچ) کي ايل سي گريڊ ACN ۾ شامل ڪيو ويو. نموني کي مختصر طور تي وورٽيڪس ڪيو ويو ۽ پوءِ 20°C تي 5 منٽن لاءِ 21,000 گرام تي سينٽرفيوج ڪيو ويو. صاف ٿيل سپرنيٽينٽ کي 2 ملي ليٽر آٽوسمپلر شيشي ۾ مخروطي شيشي جي داخل (200 μl حجم) سان منتقل ڪريو. نمونن جو تجزيو ايڪويٽي آئي ڪلاس الٽرا هاءِ پرفارمنس ايل سي سسٽم (واٽرز) استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو Q-Exactive (QE)-HF (الٽرا هاءِ فيلڊ آربيٽراپ) هاءِ ريزوليوشن پريسيشن ماس اسپيڪٽروميٽر (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) سان ڳنڍيل هو. تجزيو لاءِ، ڊيريويٽائيز ٿيل نموني جو 2μl 100×1.0 ملي ميٽر هاءِ-اسٽينٿ سليڪا T3 ڪالم (واٽرز) ۾ داخل ڪيو ويو جنهن ۾ 1.8μm ذرڙا شامل آهن. وهڪري جي شرح 100μl/منٽ آهي، ۽ بفر سسٽم ۾ بفر A (10 ايم ايم امونيم فارميٽ ۽ پاڻي ۾ 0.15٪ فارمڪ ايسڊ) ۽ بفر B (ACN) شامل آهن. گريڊينٽ هن ريت آهي: 0 منٽ تي 0٪ B؛ 0٪ B. 0 کان 0.1 منٽن تي 0 کان 15٪ B؛ 0.1 کان 0.5 منٽن تي 15 کان 17٪ B؛ 0.5 کان 14 منٽن تي 17 کان 55٪ B؛ 14 کان 14.5 منٽن تي 55 کان 70٪ B؛ 14 کان 14.5 منٽن تي 14.5 کان 70 کان 100٪ B تي 18 منٽن تي 100٪ B؛ 19 کان 19.1 منٽن تي 100 کان 0٪ B؛ 19.1 کان 28 منٽن تي 0٪ B (55، 56). QE-HF ماس اسپيڪٽروميٽر مثبت آئنائيزيشن موڊ ۾ ڪم ڪري ٿو جنهن جي ماس رينج m/z (ماس/چارج تناسب) 50 کان 750 آهي. لاڳو ٿيل ريزوليوشن 60,000 آهي، ۽ حاصل ڪيل گين ڪنٽرول (AGC) آئن ٽارگيٽ 3×106 آهي، ۽ وڌ ۾ وڌ آئن وقت 100 ملي سيڪنڊ آهي. گرم ٿيل اليڪٽرو اسپري آئنائيزيشن (ESI) ذريعو 3.5 kV جي اسپري وولٽيج، 250°C جي ڪيپيلري گرمي پد، 60 AU (منتقلي يونٽ) جي شيٿ ايئر فلو، ۽ 20 AU. 250°C جي معاون ايئر فلو تي ڪم ڪري ٿو. S لينس 60 AU تي سيٽ ڪيو ويو آهي.
اينين ​​ڪروميٽوگرافي-13C ليبل ٿيل نامياتي تيزابن جو MS تجزيو. باقي ميٽابولائٽ پريپيسيٽيٽ (55μl) جو تجزيو ڊائيونڪس آئن ڪروميٽوگرافي سسٽم (ICS 5000+، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو QE-HF ماس اسپيڪٽروميٽر (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) سان ڳنڍيل هو. مختصر ۾، ميٽابولائٽ ڪڍڻ جو 5μl هڪ ڊائيونڪس آئن پيڪ AS11-HC ڪالم ۾ HPLC (2 mm×250 mm، پارٽيڪل سائيز 4μm، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) سان ليس هو جنهن ۾ پش-ان جزوي لوپ موڊ ۾ 1 جي فلنگ ريشو سان شامل ڪيو ويو هو. ) ڊائيونڪس آئن پيڪ AG11-HC گارڊ ڪالم (2 mm x 50 mm، 4μm، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ). ڪالم جو گرمي پد 30°C تي برقرار رکيو ويو آهي، ۽ آٽو سمپلر 6°C تي سيٽ ڪيو ويو آهي. ايليوئنٽ جنريٽر ذريعي پوٽاشيم هائيڊروڪسائيڊ گريڊينٽ پيدا ڪرڻ لاءِ ڊيونائيزڊ پاڻي سان مهيا ڪيل پوٽاشيم هائيڊروڪسائيڊ ڪارٽريج استعمال ڪريو. 380μl/منٽ جي وهڪري جي شرح تي ميٽابولائٽس جي الڳ ٿيڻ، هيٺ ڏنل گريڊينٽ لاڳو ڪندي: 0 کان 3 منٽ، 10 mM KOH؛ 3 کان 12 منٽ، 10 کان 50 mM KOH؛ 12 کان 19 منٽ، 50 کان 100 mM KOH؛ 19 کان 21 منٽ، 100 mM KOH؛ 21 کان 21.5 منٽ، 100 کان 10 mM KOH. ڪالم کي 8.5 منٽن لاءِ 10 mM KOH هيٺ ٻيهر متوازن ڪيو ويو.
ايليوٽيڊ ميٽابولائٽس کي ڪالم کان پوءِ 150μl/منٽ آئسوپروپنول سپليمينٽ اسٽريم سان گڏ ڪيو ويندو آهي ۽ پوءِ منفي آئنائيزيشن موڊ ۾ ڪم ڪندڙ هڪ هاءِ ريزوليوشن ماس اسپيڪٽروميٽر ڏانهن هدايت ڪئي ويندي آهي. MS 60,000 جي ريزوليوشن سان m/z 50 کان 750 تائين ماس رينج جي نگراني ڪري رهيو آهي. AGC 1×106 تي سيٽ ڪيو ويو آهي، ۽ وڌ ۾ وڌ آئن وقت 100 ms تي رکيو ويو آهي. گرم ٿيل ESI ذريعو 3.5 kV جي اسپري وولٽيج تي هلايو ويو. آئن ذريعو جون ٻيون سيٽنگون هن ريت آهن: ڪيپيلري گرمي پد 275°C؛ شيٿ گيس فلو، 60 AU؛ معاون گيس فلو، 300°C تي 20 AU، ۽ S لينس سيٽنگ 60 AU تي.
13C ليبل ٿيل ميٽابولائٽس جو ڊيٽا تجزيو. آئسوٽوپ تناسب جي ڊيٽا تجزيو لاءِ ٽريس فائنڊر سافٽ ويئر (ورزن 4.2، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪريو. هر مرڪب جي سڃاڻپ هڪ قابل اعتماد ريفرنس مرڪب ذريعي تصديق ڪئي وئي ۽ آزادانه طور تي تجزيو ڪيو ويو. آئسوٽوپ افزودگي تجزيو ڪرڻ لاءِ، هر 13C آئسوٽوپ (Mn) جي نڪتل آئن ڪروميٽوگرام (XIC) جو علائقو [M + H] + مان ڪڍيو ويو، جتي n ٽارگيٽ مرڪب جو ڪاربن نمبر آهي، جيڪو امينو ايسڊ جو تجزيو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي يا [MH] + اينائنز جو تجزيو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. XIC جي ماس درستگي في ملين پنجن حصن کان گهٽ آهي، ۽ RT جي درستگي 0.05 منٽ آهي. افزودگي تجزيو هر معلوم ٿيل آئسوٽوپ جي تناسب کي لاڳاپيل مرڪب جي سڀني آئسوٽوپس جي مجموعن جي حساب سان ڪيو ويندو آهي. اهي تناسب هر آئسوٽوپ لاءِ فيصد قدرن جي طور تي ڏنا ويا آهن، ۽ نتيجا مولر سيڪڙو افزودگي (MPE) جي طور تي ظاهر ڪيا ويا آهن، جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي (42).
منجمد نيورون پيلٽ کي برف جي ٿڌي 80٪ ميٿانول (v/v) ۾ هڪجهڙائي ڪئي وئي، وورٽيڪس ڪيو ويو، ۽ -20 ° C تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. نموني کي ٻيهر گھمايو ۽ +4 ° C تي 30 منٽن لاءِ هلايو. نموني کي 21,000 گرام تي 4 ° C تي 5 منٽن لاءِ سينٽرفيوج ڪيو ويو، ۽ پوءِ نتيجي ۾ پيدا ٿيندڙ سپرنيٽينٽ کي بعد ۾ تجزيو لاءِ 25 ° C تي اسپيڊ ويڪ ڪنسنٽريٽر استعمال ڪندي گڏ ڪيو ويو ۽ خشڪ ڪيو ويو. جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي، ترتيب ڏنل سيلز جي امينو ايسڊ تي LC-MS تجزيو ڪيو ويو. ٽريس فائنڊر (ورژن 4.2، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪندي، ڊيٽا تجزيو هر مرڪب جي مونوسوٽوپڪ ماس استعمال ڪندي ڪيو ويو. ميٽابولائٽ ڊيٽا جي مقداري نارملائيزيشن پري پروسيس ڪور سافٽ ويئر پيڪيج (57) استعمال ڪندي ڪئي وئي.
سلائس تيار ڪرڻ. مائوس کي ڪاربن ڊاءِ آڪسائيڊ سان جلدي بي هوشي ڪئي وئي ۽ ان جو سر ڪٽيو ويو، دماغ کي جلدي کوپڙي مان ڪڍيو ويو، ۽ برف سان ڀريل وائبريٽنگ چاقو (HM-650 V، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، والڊورف، جرمني) استعمال ڪيو ويو ته جيئن ان کي 300 کان 375 μm ساگيٽل حصن ۾ ڪٽي سگهجي. ٿڌي ڪاربن گيسيفڪيشن (95٪ O2 ۽ 5٪ CO2) گھٽ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڊيم فاسفيٽ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلوڪوز، 1.0 mM CaCl2 ۽ 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 ۽ 310 کان 330 mOsm تائين ترتيب ڏيو). حاصل ڪيل دماغي سلائسن کي هڪ چيمبر ۾ منتقل ڪريو جنهن ۾ وڌيڪ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڊيم فاسفيٽ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلوڪوز، 4.0 mM CaCl2 ۽ mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ۽ 310 کان 320 mOsm هجي. سلائسن کي 20 کان 30 منٽن تائين ذخيرو ڪريو ته جيئن انهن کي رڪارڊ ڪرڻ کان اڳ بحال ڪري سگهجي.
رڪارڊنگ. هڪ مائڪروسڪوپ اسٽيج جيڪو هڪ مقرر ٿيل رڪارڊنگ چيمبر ۽ 20x پاڻي جي وسرندڙ آبجيڪٽو لينس (سائنٽيفيڪا) سان ليس هو، سڀني رڪارڊنگ لاءِ استعمال ڪيو ويو. پوٽيٽو پورڪينج سيلز جي سڃاڻپ (i) جسم جي سائيز، (ii) سيريبيلم جي جسماني جڳهه، ۽ (iii) فلوروسينٽ mtYFP رپورٽر جين جي اظهار ذريعي ڪئي وئي. 5 کان 11 ميگاهم جي ٽپ مزاحمت سان پيچ پائيپٽ کي بوروسيليڪيٽ گلاس ڪيپيلري (GB150-10، 0.86 ملي ميٽر × 1.5 ملي ميٽر × 100 ملي ميٽر، سائنس پراڊڪٽس، هوفهيم، جرمني) ۽ هڪ افقي پائيپٽ انسٽرومينٽس (P-1000، سٽر)، نوواٽو، CA) ذريعي ڪڍيو ويندو آهي. سڀئي رڪارڊنگ ELC-03XS npi پيچ ڪلمپ ايمپليفائر (npi اليڪٽرانڪ GmbH، ٽام، جرمني) پاران ڪيون ويون، جيڪو سافٽ ويئر سگنل (ورزن 6.0، ڪيمبرج اليڪٽرانڪ، ڪيمبرج، برطانيه) پاران ڪنٽرول ڪيو ويو. تجربو 12.5 kHz جي نموني جي شرح تي رڪارڊ ڪيو ويو. سگنل کي ٻن شارٽ پاس بيسل فلٽرن سان فلٽر ڪيو ويندو آهي جن جي ڪٽ آف فريڪوئنسي ترتيب وار 1.3 ۽ 10 ڪلو هرٽز آهي. جھلي ۽ پائپٽ جي گنجائش کي ايمپليفائر استعمال ڪندي معاوضي سرڪٽ ذريعي معاوضو ڏنو ويندو آهي. سڀئي تجربا هڪ اورڪا-فليش 4.0 ڪئميرا (هماماتسو، گرڊن، جرمني) جي ڪنٽرول هيٺ ڪيا ويا، جيڪو هوڪاوو سافٽ ويئر (ورزن 2.8، هاماماتسو، گرڊن، جرمني) پاران ڪنٽرول ڪيو ويو.
معمول جي پوري سيل جي ترتيب ۽ تجزيو. رڪارڊنگ کان فوري طور تي، پائپٽ کي اندروني محلول سان ڀريو جنهن ۾ هيٺيان مادا شامل آهن: 4.0 mM KCl، 2.0 mM NaCl، 0.2 mM EGTA، 135.0 mM پوٽاشيم گلوڪوونيٽ، 10.0 mM هيپس، 4.0 mM ATP (Mg)، 0.5 mM گوانوسين ٽرائيفاسفيٽ (GTP) (Na) ۽ 10.0 mM ڪريٽينائن فاسفيٽ کي pH 7.25 تي ترتيب ڏنو ويو، ۽ آسموٽڪ پريشر 290 mOsm (sucrose) هو. جھلي کي ڦاٽڻ لاءِ 0 pA جي قوت لاڳو ڪرڻ کان فوري طور تي، آرام ڪندڙ جھلي جي صلاحيت ماپي وئي. ان پٽ مزاحمت -40، -30، -20، ۽ -10 pA جي هائپرپولرائزڊ ڪرنٽ لاڳو ڪندي ماپي ويندي آهي. وولٽيج جي جواب جي شدت کي ماپيو ۽ ان پٽ مزاحمت کي ڳڻڻ لاءِ اوهم جي قانون کي استعمال ڪريو. 5 منٽن لاءِ وولٽيج ڪلمپ ۾ خود بخود سرگرمي رڪارڊ ڪئي وئي، ۽ ايس پي ايس سي کي ايگور پرو (ورژن 32 7.01، ويو ميٽرڪس، ڍنڍ اوسويگو، اوريگون، آمريڪا) ۾ نيم خودڪار سڃاڻپ اسڪرپٽ استعمال ڪندي سڃاڻپ ۽ ماپ ڪئي وئي. IV وکر ۽ مستحڪم رياستي ڪرنٽ کي مختلف پوٽينشلز (-110 mV کان شروع ٿيندڙ) تي بيٽري کي ڪلمپ ڪندي ۽ 5 mV مرحلن ۾ وولٽيج وڌائي ماپيو ويندو آهي. AP جي پيداوار کي ڊيپولرائيزنگ ڪرنٽ لاڳو ڪندي جانچيو ويو. ڊيپولرائيزنگ ڪرنٽ پلس لاڳو ڪندي سيل کي -70 mV تي ڪلمپ ڪريو. هر رڪارڊنگ يونٽ جي قدم جي سائيز کي الڳ الڳ ترتيب ڏيو (10 کان 60 pA). دستي طور تي پلس اسپائڪس کي ڳڻڻ سان وڌ ۾ وڌ AP فريڪوئنسي جو حساب ڪريو جيڪي سڀ کان وڌيڪ AP فريڪوئنسي جو سبب بڻجن ٿا. AP حد جو تجزيو ڊيپولرائيزيشن پلس جي ٻئي ڊيريويٽو استعمال ڪندي ڪيو ويندو آهي جيڪو پهريان هڪ يا وڌيڪ APs کي متحرڪ ڪري ٿو.
سوراخ ٿيل پيچ جي ترتيب ۽ تجزيو. معياري پروٽوڪول استعمال ڪندي سوراخ ٿيل پيچ رڪارڊنگ انجام ڏيو. هڪ ATP- ۽ GTP-مفت پائيپٽ استعمال ڪريو جنهن ۾ هيٺيان اجزا شامل نه هجن: 128 mM گلوڪوونيٽ K، 10 mM KCl، 10 mM هيپس، 0.1 mM EGTA ۽ 2 mM MgCl2، ۽ pH 7.2 (KOH استعمال ڪندي) سان ترتيب ڏيو. سيل جھلي جي بي قابو پارگميتا کي روڪڻ لاءِ ATP ۽ GTP کي اندروني حل مان خارج ڪيو ويو آهي. پيچ پائيپٽ کي امفوٽيريسن تي مشتمل اندروني حل (تقريبن 200 کان 250μg/ml؛ G4888، سگما-الڊرچ) سان ڀريو ويندو آهي ته جيئن هڪ پنچ ٿيل پيچ رڪارڊ حاصل ڪري سگهجي. امفوٽيريسن کي ڊائي ميٿائل سلفوڪسائيڊ ۾ حل ڪيو ويو (آخري ڪنسنٽريشن: 0.1 کان 0.3٪؛ DMSO؛ D8418، سگما-الڊرچ). استعمال ٿيل DMSO جي ڪنسنٽريشن جو مطالعي ڪيل نيورون تي ڪو خاص اثر نه پيو. پنچنگ جي عمل دوران، چينل مزاحمت (Ra) جي مسلسل نگراني ڪئي وئي، ۽ تجربو Ra ۽ AP جي طول و عرض (20-40 منٽ) جي مستحڪم ٿيڻ کان پوءِ شروع ڪيو ويو. خود بخود سرگرمي کي وولٽيج ۽/يا ڪرنٽ ڪلمپ ۾ 2 کان 5 منٽن تائين ماپيو ويندو آهي. ڊيٽا تجزيو Igor Pro (ورژن 7.05.2، WaveMetrics، USA)، Excel (ورزن 2010، Microsoft Corporation، Redmond، USA) ۽ GraphPad Prism (ورزن 8.1.2، GraphPad Software Inc.، La Jolla، CA) استعمال ڪندي ڪيو ويو. خود بخود APs جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ، IgorPro جو NeuroMatic v3.0c پلگ ان استعمال ڪيو ويندو آهي. ڏنل حد استعمال ڪندي APs جي خودڪار سڃاڻپ ڪريو، جيڪو هر رڪارڊ لاءِ انفرادي طور تي ترتيب ڏنو ويندو آهي. اسپائڪ وقفو استعمال ڪندي، اسپائڪ فريڪوئنسي کي وڌ ۾ وڌ فوري اسپائڪ فريڪوئنسي ۽ سراسري اسپائڪ فريڪوئنسي سان طئي ڪريو.
پي اين آئسوليشن. اڳ ۾ شايع ٿيل پروٽوڪول کي اپنائڻ سان، پي اين کي هڪ مخصوص مرحلي تي مائوس سيريبيلم مان صاف ڪيو ويو (58). مختصر ۾، سيريبيلم کي برف جي ٿڌي ڊيسوسيئيشن ميڊيم ۾ ڪٽيو ويو ۽ ڪٽيو ويو [HBSS Ca2+ ۽ Mg2+ کان سواءِ، 20 ايم ايم گلوڪوز، پينسلين (50 يو / ايم ايل) ۽ اسٽريپٽو مائيسن (0.05 ايم ايل / ايم ايل) سان گڏ]، ۽ پوءِ ميڊيم کي پيپين ۾ هضم ڪيو ويو [HBSS، 1-سسٽين·ايڇ سي ايل (1 ايم ايل / ايم ايل)، پيپين (16 يو / ايم ايل) ۽ ڊي آڪسي رائيبونڪليئيز I (DNase I؛ 0.1 ايم ايل / ايم ايل) سان گڏ] 30 منٽن لاءِ 30 ° سي تي علاج ڪريو. پهرين ٽشوز کي HBSS ميڊيم ۾ ڌوئو جنهن ۾ انڊي بلغم (10 mg/ml)، BSA (10 mg/ml) ۽ DNase (0.1 mg/ml) شامل آهن ته جيئن اينزيميٽڪ هضم کي روڪي سگهجي، ۽ پوءِ 20 mM گلوڪوز تي مشتمل HBSS ميڊيم ۾ HBSS ۾ نرميءَ سان پيسڻ سان، پينسلين (50 U/ml)، اسٽريپٽومائسن (0.05 mg/ml) ۽ DNase (0.1 mg/ml) سنگل سيلز کي آزاد ڪن ٿا. نتيجي ۾ سيل سسپنشن کي 70μm سيل اسٽرينر ذريعي فلٽر ڪيو ويو، پوءِ سيلز کي سينٽرفيوگيشن (1110 rpm، 5 منٽ، 4°C) ذريعي پيلٽ ڪيو ويو ۽ ترتيب ڏيڻ واري ميڊيم ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو [HBSS، 20 mM گلوڪوز، 20٪ فيٽل بووائن) سيرم، پينسلين (50 U/ml) ۽ اسٽريپٽومائسن (0.05 mg/ml)]؛ پروپيڊيم آئوڊائيڊ سان سيل جي عملداري جو جائزو وٺو ۽ سيل جي کثافت کي 1×106 کان 2×106 سيلز/ml تائين ترتيب ڏيو. فلو سائٽوميٽري کان اڳ، معطلي کي 50 μm سيل اسٽرينر ذريعي فلٽر ڪيو ويو.
فلو سائيٽو ميٽر. سيل جي ترتيب FACSAria III مشين (BD بايو سائنسز) ۽ FACSDiva سافٽ ويئر (BD بايو سائنسز، ورجن 8.0.1) استعمال ڪندي 4°C تي ڪئي وئي. سيل سسپنشن کي 100 μm نوزل ​​استعمال ڪندي 20 psi جي دٻاءُ هيٺ ~2800 واقعن/سيڪنڊ جي شرح سان ترتيب ڏنو ويو. جيئن ته روايتي گيٽنگ معيار (سيل سائيز، بائي موڊل امتياز، ۽ اسڪيٽرنگ خاصيتون) ٻين سيل قسمن کان PN جي صحيح الڳ ٿيڻ کي يقيني نه ٿا بڻائي سگهن، گيٽنگ حڪمت عملي mitoYFP+ ​​۽ ڪنٽرول mitoYFP - چوٿين ۾ YFP شدت ۽ آٽو فلوروسينس جي سڌي مقابلي جي بنياد تي مقرر ڪئي وئي آهي. YFP 488 nm ليزر لائن سان نموني کي شعاع ڏيڻ سان پرجوش ٿئي ٿو، ۽ سگنل 530/30 nm بينڊ پاس فلٽر استعمال ڪندي ڳوليو ويندو آهي. mitoYFP+ ​​چوٿين ۾، Rosa26-mitoYFP رپورٽر جين جي نسبتي طاقت پڻ نيورونل جسم ۽ ايڪسون ٽڪرن کي فرق ڪرڻ لاءِ استعمال ڪئي ويندي آهي. 7-AAD کي 561 nm پيلي ليزر سان پرجوش ڪيو ويو آهي ۽ 675/20 nm بينڊ پاس فلٽر سان ڳوليو ويو آهي ته جيئن مئل سيلز کي خارج ڪري سگهجي. ساڳئي وقت ايسٽروسائٽس کي الڳ ڪرڻ لاءِ، سيل سسپنشن کي ACSA-2-APC سان داغ ڏنو ويو، پوءِ نموني کي 640 nm ليزر لائن سان شعاع ڪيو ويو، ۽ سگنل کي ڳولڻ لاءِ 660/20 nm بينڊ پاس فلٽر استعمال ڪيو ويو.
گڏ ڪيل سيلز کي سينٽرفيوگيشن (1110 rpm، 5 منٽ، 4°C) ذريعي پيليٽ ڪيو ويو ۽ استعمال تائين -80°C تي ذخيرو ڪيو ويو. Mfn2cKO چوٿون ۽ انهن جي ڪچري جا ٻچا ساڳئي ڏينهن تي درجه بندي ڪيا ويا آهن ته جيئن طريقيڪار جي تبديلي کي گهٽائي سگهجي. FACS ڊيٽا پيشڪش ۽ تجزيو FlowJo سافٽ ويئر (FlowJo LLC، Ashland، Oregon، USA) استعمال ڪندي ڪيو ويو.
جيئن مٿي ذڪر ڪيو ويو آهي (59)، ريئل ٽائيم پي سي آر کي ترتيب ڏنل نيورونز مان ڊي اين اي کي الڳ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي بعد ۾ ايم ٽي ڊي اين اي ڪوانٽيفڪيشن لاءِ. لڪيريٽي ۽ حد جي حساسيت کي شروعاتي طور تي مختلف سيلز تي qPCR هلائي جانچيو ويو. مختصر ۾، 50 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل (پي ايڇ 8.5)، 1 ايم ايم اي ڊي ٽي اي، 0.5٪ ٽوئن 20 ۽ پروٽينيس ڪي (200 اين جي/ايم ايل) تي مشتمل هڪ ليسس بفر ۾ 300 پي اين گڏ ڪريو ۽ 55 ° سي 120 منٽن تي انڪيوبيٽ ڪريو. پروٽينيس ڪي جي مڪمل غير فعال ٿيڻ کي يقيني بڻائڻ لاءِ سيلز کي 10 منٽن لاءِ 95 ° سي تي وڌيڪ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. mt-Nd1 لاءِ مخصوص TaqMan پروب (ٿرمو فشر) استعمال ڪندي، mtDNA کي 7900HT ريئل ٽائيم پي سي آر سسٽم (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) ۾ نيم مقداري پي سي آر ذريعي ماپيو ويو. سائنس، ڪيٽلاگ نمبر Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، ڪيٽلاگ نمبر AIVI3E8) ۽ 18S (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، ڪيٽلاگ نمبر Hs99999901_s1) جينز.
پروٽوم نموني جي تياري. محلول کي 95°C تي 10 منٽن لاءِ گرم ڪرڻ ۽ سونيڪٽ ڪرڻ سان، ليسس بفر ۾ [6 M گوانڊائن ڪلورائڊ، 10 mM ٽريس (2-ڪاربوڪسيٿيل) فاسفائن هائيڊرو ڪلورائڊ، 10 mM ڪلورواسٽامائيڊ ۽ 100 mM ٽريس- لائس منجمد نيورون پيليٽس HCl ۾]. 10 منٽن لاءِ بايو رپٽر (ڊياگينوڊ) تي (30 سيڪنڊ پلس / 30 سيڪنڊن جي وقفي جي مدت). نموني کي 20 mM ٽريس-ايڇ سي ايل (pH 8.0) ۾ 1:10 تي ملائي، 300 اين جي ٽرپسن گولڊ (پروميگا) سان ملايو ويو، ۽ مڪمل هضم حاصل ڪرڻ لاءِ رات جو 37°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ٻئي ڏينهن، نموني کي 20 منٽن لاءِ 20,000 گرام تي سينٽرفيوج ڪيو ويو. سپرنيٽنٽ کي 0.1٪ فارمڪ ايسڊ سان ملائي ڇڏيو ويو، ۽ محلول کي خود ٺاهيل اسٽيج ٽِپس سان ڊيسالٽ ڪيو ويو. نموني کي اسپيڊ ويڪ اوزار (ايپينڊورف ڪنسنٽريٽر پلس 5305) ۾ 45 °C تي خشڪ ڪيو ويو، ۽ پوءِ پيپٽائيڊ کي 0.1٪ فارمڪ ايسڊ ۾ معطل ڪيو ويو. سڀئي نمونا هڪ ​​ئي شخص پاران هڪ ئي وقت تيار ڪيا ويا. ايسٽروسائيٽ نمونن جو تجزيو ڪرڻ لاءِ، 4 μg ڊيسالٽ ٿيل پيپٽائڊس کي ٽينڊم ماس ٽيگ (TMT10plex، ڪيٽلاگ نمبر 90110، Thermo Fisher Scientific) سان ليبل ڪيو ويو جنهن جو پيپٽائيڊ کان TMT ريجنٽ تناسب 1:20 هو. TMT ليبلنگ لاءِ، 0.8 mg TMT ريجنٽ کي 70 μl اينهائيڊروس ACN ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو، ۽ خشڪ پيپٽائيڊ کي 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) جي 9 μl ۾ ٻيهر ترتيب ڏنو ويو، جنهن ۾ ACN ۾ 7 μl TMT ريجنٽ شامل ڪيو ويو. ڪنسنٽريشن 43.75٪ هئي. انڪيوبيشن جي 60 منٽن کان پوءِ، رد عمل کي 2 μl 5٪ هائيڊروڪسيلامين سان ختم ڪيو ويو. ليبل ٿيل پيپٽائڊس کي گڏ ڪيو ويو، خشڪ ڪيو ويو، 0.1٪ فارمڪ ايسڊ (FA) جي 200μl ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو، ٻن حصن ۾ ورهايو ويو، ۽ پوءِ پاڻ ٺاهيل اسٽيج ٽِپس استعمال ڪندي ڊيسالٽ ڪيو ويو. الٽي ميٽ 3000 الٽرا هاءِ پرفارمنس مائع ڪروميٽوگراف (الٽي ميٽ 3000 الٽرا هاءِ پرفارمنس مائع ڪروميٽوگراف) استعمال ڪندي، ٻن حصن مان هڪ کي 1mm x 150mm ايڪويٽي ڪروميٽوگرافڪ ڪالم تي ورهايو ويو جيڪو 130Å1.7μm C18 ذرات سان ڀريل هو (واٽر، ڪيٽلاگ نمبر SKU: 186006935). ٿرمو فشر سائنٽيفڪ). پيپٽائڊس کي 30μl/منٽ جي وهڪري جي شرح تي الڳ ڪريو، 1٪ کان 50٪ بفر B کان 85 منٽن لاءِ 96 منٽن جي قدم وار گريڊينٽ سان الڳ ڪريو، 50٪ کان 95٪ بفر B کان 3 منٽن لاءِ، پوءِ 95٪ بفر B لاءِ 8 منٽ؛ بفر A 5% ACN ۽ 10 mM امونيم بائيڪاربونيٽ (ABC) آهي، ۽ بفر B 80% ACN ۽ 10 mM ABC آهي. هر 3 منٽن ۾ ڪَڪشن گڏ ڪريو ۽ انهن کي ٻن گروپن (1 + 17، 2 + 18، وغيره) ۾ ملائي ۽ انهن کي ويڪيوم سينٽريفيوج ۾ خشڪ ڪريو.
LC-MS/MS تجزيو. ماس اسپيڪٽروميٽري لاءِ، پيپٽائڊس (نمبر r119.aq) کي 25 سينٽي ميٽر، 75 μm اندروني قطر جي PicoFrit تجزياتي ڪالم (نئون آبجيڪٽو لينس، حصو نمبر PF7508250) تي الڳ ڪيو ويو جيڪو 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ ميڊيم (ڊاڪٽر ماش، ميٽ) سان ليس هو، EASY-nLC 1200 استعمال ڪريو (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، جرمني). ڪالم کي 50 °C تي برقرار رکيو ويو. بفر A ۽ B پاڻي ۾ 0.1% فارمڪ ايسڊ ۽ 80% ACN ۾ 0.1% فارمڪ ايسڊ آهن، ترتيب وار. پيپٽائڊس کي 65 منٽن لاءِ 6% کان 31% بفر B ۽ 31% کان 50% بفر B کان 5 منٽن لاءِ 200 nl/min جي گريڊينٽ سان الڳ ڪيو ويو. ايليوٽيڊ پيپٽائڊس جو تجزيو هڪ اوربٽراپ فيوزن ماس اسپيڪٽروميٽر (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) تي ڪيو ويو. پيپٽائڊ اڳڪٿي m/z ماپ 350 کان 1500 m/z جي حد ۾ 120,000 جي ريزوليوشن سان ڪئي وئي آهي. 27٪ نارملائيزڊ ڪوليشن انرجي استعمال ڪندي، 2 کان 6 جي چارج اسٽيٽ سان مضبوط ترين اڳڪٿي کي هاءِ انرجي سي ٽريپ ڊسوسيئيشن (HCD) ڪليويج لاءِ چونڊيو ويو آهي. سائيڪل جو وقت 1 سيڪنڊ تي مقرر ڪيو ويو آهي. پيپٽائڊ فريگمينٽ جي m/z ويليو کي آئن ٽريپ ۾ 5×104 جي ننڍڙي AGC ٽارگيٽ ۽ 86 ms جي وڌ ۾ وڌ انجيڪشن وقت استعمال ڪندي ماپيو ويو. فريگمينٽيشن کان پوءِ، پريگرس کي 45 سيڪنڊن لاءِ متحرڪ خارج ڪرڻ واري فهرست تي رکيو ويو. TMT-ليبل ٿيل پيپٽائڊس کي 50 سينٽي ميٽر، 75 μm ايڪليم پيپ ميپ ڪالم (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، ڪيٽلاگ نمبر 164942) تي الڳ ڪيو ويو، ۽ مائيگريشن اسپيڪٽرا جو تجزيو هڪ Orbitrap Lumos Tribrid ماس اسپيڪٽروميٽر (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) تي ڪيو ويو جيڪو هاءِ فيلڊ اسيميٽرڪ ويوفارم آئنز (FAIMS) سامان سان ليس آهي (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) -50 ۽ -70 V جي ٻن معاوضي وولٽيج تي ڪم ڪري ٿو. سنڪرونائيزيشن پريڪرسر جي بنياد تي چونڊيل MS3 TMT رپورٽ آئن سگنل جي ماپ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. پيپٽائڊ جي علحدگي EASY-nLC 1200 تي ڪئي وئي، 90٪ لڪير گريڊينٽ ايليوشن استعمال ڪندي، 6٪ کان 31٪ جي بفر ڪنسنٽريشن سان؛ بفر A 0.1٪ FA هو، ۽ بفر B 0.1٪ FA ۽ 80٪ ACN هو. تجزياتي ڪالم 50 ° C تي هلايو ويندو آهي. FAIMS معاوضي وولٽيج جي مطابق اصل فائل کي ورهائڻ لاءِ فري اسٽائل (ورزن 1.6، ٿرمو فشر سائنٽيفڪ) استعمال ڪريو.
پروٽين جي سڃاڻپ ۽ مقدار جي تصديق. مربوط اينڊروميڊا سرچ انجن استعمال ڪندي، اصل ڊيٽا جو تجزيو MaxQuant ورجن 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) استعمال ڪندي ڪيو ويو. Aequorea victoria مان حاصل ڪيل Cre recombinase ۽ YFP sequences کان علاوه، peptide fragment spectra کي مائوس ريفرنس پروٽوم (Proteome ID UP000000589، مئي 2017 ۾ UniProt تان ڊائون لوڊ ڪيل) جي ڪيننيڪل sequence ۽ isoform sequence لاءِ ڳولا ڪئي وئي. Methionine آڪسائيڊشن ۽ پروٽين N-ٽرمينل ايسٽيليشن کي متغير تبديلين جي طور تي مقرر ڪيو ويو؛ سسٽين ڪارباموئل ميٿيليشن کي مقرر تبديلين جي طور تي مقرر ڪيو ويو. هضم جا پيرا ميٽر "specificity" ۽ "trypsin/P" تي مقرر ڪيا ويا آهن. پروٽين جي سڃاڻپ لاءِ استعمال ٿيندڙ پيپٽائڊس ۽ ريزر پيپٽائڊس جو گھٽ ۾ گھٽ تعداد 1 آهي؛ منفرد پيپٽائڊس جو گھٽ ۾ گھٽ تعداد 0 آهي. پيپٽائڊ نقشي جي ميلاپ جي حالتن هيٺ، پروٽين جي سڃاڻپ جي شرح 0.01 هئي. "ٻيو پيپٽائڊ" آپشن فعال آهي. مختلف اصل فائلن جي وچ ۾ ڪامياب سڃاڻپ کي منتقل ڪرڻ لاءِ "رن جي وچ ۾ ميچ" آپشن استعمال ڪريو. ليبل فري ڪوانٽيفڪيشن (LFQ) (60) لاءِ LFQ گھٽ ۾ گھٽ تناسب ڳڻپ 1 استعمال ڪريو. LFQ شدت کي گھٽ ۾ گھٽ ٻن صحيح قدرن لاءِ فلٽر ڪيو ويندو آھي گھٽ ۾ گھٽ ھڪ جينوٽائپ گروپ ۾ ھر وقت پوائنٽ تي، ۽ ھڪڙي عام تقسيم مان ٻاھر ڪڍيو ويندو آھي جنھن جي ويڪر 0.3 آھي ۽ 1.8 ھيٺ لھي ويندي آھي. LFQ نتيجن جو تجزيو ڪرڻ لاءِ Perseus ڪمپيوٽنگ پليٽ فارم (https://maxquant.net/perseus/) ۽ R (https://r-project.org/) استعمال ڪريو. ليما سافٽ ويئر پيڪيج مان ھڪ ٻہ طرفي اعتدال پسند ٽي ٽيسٽ ڊفرنشل ايڪسپريشن تجزيو لاءِ استعمال ڪيو ويو (61). ايڪسپلوريٽري ڊيٽا تجزيو ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally ۽ phetmap استعمال ڪندي ڪيو ويندو آھي. TMT تي ٻڌل پروٽومڪس ڊيٽا جو تجزيو MaxQuant ورجن 1.6.10.43 استعمال ڪندي ڪيو ويو. يوني پروٽ جي انساني پروٽومڪس ڊيٽابيس مان خام پروٽومڪس ڊيٽا جي ڳولا ڪريو، جيڪو سيپٽمبر 2018 ۾ ڊائون لوڊ ڪيو ويو هو. تجزيي ۾ ٺاهيندڙ پاران مهيا ڪيل آئسوٽوپ پاڪائي اصلاح عنصر شامل آهي. فرق جي اظهار جي تجزيي لاءِ R ۾ ليما استعمال ڪريو. اصل ڊيٽا، ڊيٽابيس ڳولا جا نتيجا، ۽ ڊيٽا تجزيو ورڪ فلو ۽ نتيجا سڀ پروٽوم ايڪسچينج الائنس ۾ PRIDE پارٽنر ريپوزٽري ذريعي ڊيٽا سيٽ سڃاڻپ ڪندڙ PXD019690 سان محفوظ ڪيا ويا آهن.
فنڪشنل اينوٽيشنز تجزيي کي وڌيڪ مالا مال ڪن ٿا. انجينيوٽي پاٿ وي اينالائسز (QIAGEN) ٽول 8 هفتن تي ڊيٽا سيٽ جي فنڪشنل اينوٽيشن اصطلاحن جي دولت کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو (شڪل 1). مختصر ۾، LC-MS/MS (ٽينڊم ماس اسپيڪٽروميٽري) ڊيٽا تجزيي مان حاصل ڪيل مقداري پروٽين لسٽ کي هيٺين فلٽر معيار سان استعمال ڪيو ويندو آهي: مس مسڪولس کي نسل ۽ پس منظر جي طور تي چونڊيو ويندو آهي، ۽ ڪيٽيگري ڏيکاري ٿي ته بنجاميني پاران 0.05 يا گهٽ افزودگي لاءِ ترتيب ڏنل P قدر کي اهم سمجهيو ويندو آهي. هن گراف لاءِ، ترتيب ڏنل P قدر جي بنياد تي هر ڪلسٽر ۾ مٿين پنج اضافي درجا ڏيکاريا ويا آهن. ڪيترن ئي ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي، بنجاميني، ڪريگر، ۽ يڪوتيلي (Q = 5٪) جي ٻن-اسٽيج لائينئر بوسٽ پروگرام کي استعمال ڪندي، هر درجي ۾ سڃاڻپ ڪيل اهم اميدوارن تي وقت جي ڪورس پروٽين ايڪسپريشن تجزيو ڪيو ويندو آهي، ۽ هر قطار کي الڳ الڳ تجزيو ڪيو ويندو آهي. هڪجهڙائي SD اختيار ڪرڻ جي ڪا ضرورت ناهي.
هن مطالعي جي نتيجن کي شايع ٿيل ڊيٽابيس سان مقابلو ڪرڻ ۽ شڪل 1 ۾ وين ڊاگرام ٺاهڻ لاءِ، اسان مقداري پروٽين جي فهرست کي ميٽو ڪارٽا 2.0 تشريح (24) سان گڏ ڪيو. ڊاگرام ٺاهڻ لاءِ آن لائن ٽول ڊرا وين ڊاگرام (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) استعمال ڪريو.
پروٽومڪس تجزيي لاءِ استعمال ٿيندڙ شمارياتي طريقيڪار بابت تفصيلي معلومات لاءِ، مھرباني ڪري مواد ۽ طريقن جي لاڳاپيل حصي جو حوالو ڏيو. ٻين سڀني تجربن لاءِ، تفصيلي معلومات لاڳاپيل ڏند ڪٿا ۾ ملي سگھي ٿي. جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو وڃي، سڀ ڊيٽا اوسط ± SEM طور ظاهر ڪيا ويا آهن، ۽ سڀئي شمارياتي تجزيا گراف پيڊ پرزم 8.1.2 سافٽ ويئر استعمال ڪندي ڪيا ويا.
هن مضمون لاءِ اضافي مواد لاءِ، مهرباني ڪري ڏسو http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
هي هڪ کليل رسائي وارو مضمون آهي جيڪو ڪريٽو ڪامنز انتساب-غير-ڪمرشل لائسنس جي شرطن تحت ورهايو ويو آهي، جيڪو ڪنهن به وچولي ۾ استعمال، ورڇ ۽ ٻيهر پيداوار جي اجازت ڏئي ٿو، جيستائين آخري استعمال تجارتي فائدي لاءِ نه هجي ۽ بنياد اهو هجي ته اصل ڪم صحيح آهي. حوالو.
نوٽ: اسان توهان کي صرف پنهنجو اي ميل پتو ڏيڻ لاءِ چئون ٿا ته جيئن توهان جنهن شخص کي صفحي تي سفارش ڪري رهيا آهيو اهو ڄاڻي ته توهان چاهيو ٿا ته اهي اي ميل ڏسن ۽ اهو اسپام نه آهي. اسان ڪو به اي ميل پتو نه پڪڙينداسين.
هي سوال جانچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته ڇا توهان هڪ مهمان آهيو ۽ خودڪار اسپام جمع ڪرائڻ کي روڪڻ لاءِ.
E. Motori، I. Atanasov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.-G. لارسن
غير فعال نيورونز جي پروٽومڪس تجزيي مان ظاهر ٿيو ته ميٽابولڪ پروگرام نيوروڊيجنريشن کي منهن ڏيڻ لاءِ چالو ٿين ٿا.
E. Motori، I. Atanasov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.-G. لارسن
غير فعال نيورونز جي پروٽومڪس تجزيي مان ظاهر ٿيو ته ميٽابولڪ پروگرام نيوروڊيجنريشن کي منهن ڏيڻ لاءِ چالو ٿين ٿا.
©2020 سائنس جي ترقي لاء آمريڪي ايسوسيئيشن. سڀ حق محفوظ آهن. AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef ۽ COUNTER جو شريڪ آھي. سائنس ايڊوانسز ISSN 2375-2548.