موجوده†موجوده پتو: OX11 0DE، برطانيه، ڊائمنڊ بلڊنگ، هارويل سائنس ۽ انوويشن پارڪ، ڊائٽڪوٽ، آڪسفورڊ شائر، برطانيه، ڊائمنڊ لائيٽ سورس ڪمپني، لميٽيڊ، اليڪٽرانڪ بايولوجيڪل اميجنگ سينٽر.
رد عمل مرڪز روشني-حاصل ڪرڻ وارو ڪمپليڪس 1 (RC-LH1) جامني فوٽوٽروفڪ بيڪٽيريا جو بنيادي فوٽوسنٿيٽڪ جزو آهي. اسان روڊوپسوڊوموناس پالسٽرس مان RC-LH1 ڪمپليڪس جا ٻه ڪرائو-اليڪٽران مائڪروسڪوپي ڍانچا متعارف ڪرايا. RC-LH114-W ڪمپليڪس جي 2.65-Å ريزوليوشن ڍانچي ۾ RC جي چوڌاري 14 سب يونٽ LH1 لوپ شامل آهن، جيڪو پروٽين W ذريعي مداخلت ڪري ٿو، جڏهن ته پروٽين-W کان سواءِ ڪمپليڪس مڪمل طور تي RC جي چوڌاري RC جوڙجڪ آهي. بند ٿيل 16 سب يونٽ LH1 لوپ. انهن ڍانچن جو مقابلو RC-LH1 ڪمپليڪس ۾ ڪوئنون جي حرڪيات ۾ بصيرت فراهم ڪري ٿو، جنهن ۾ RC QB سائيٽ تي ڪوئنون کي پابند ڪرڻ وقت اڳ ۾ غير متعين ڪنفرميشنل تبديليون شامل آهن، انهي سان گڏ معاون ڪوئنون بائنڊنگ سائيٽن جو مقام، جيڪي انهن کي RC ڏانهن منتقل ڪرڻ ۾ مدد ڪن ٿا. W پروٽين جي منفرد ڍانچي LH1 لوپ جي بندش کي روڪي ٿي، ان ڪري ڪوئنون/ڪوئنولون ايڪسچينج کي تيز ڪرڻ لاءِ هڪ چينل ٺاهي ٿي.
فوٽو سنٿيسس ذريعي فراهم ڪيل توانائي زمين تي تقريبن سڀني زندگين کي برقرار رکي سگهي ٿي، ۽ ان ۾ شمسي بايو ٽيڪنالاجي لاءِ وڏي صلاحيت آهي. عالمي فوٽو سنٿيسس کي فروغ ڏيڻ دوران، جامني فوٽو ٽروفڪ بيڪٽيريا مختلف توانائي جي طريقن ۽ ميٽابولڪ صلاحيتن کي پڻ ظاهر ڪن ٿا. اهي فوٽو سنٿيسس کان پاسو ڪري سگهن ٿا ۽ اونداهي ۾ هيٽروٽروفڪ بيڪٽيريا جي طور تي وڌي سگهن ٿا، نائٽروجن ۽ ڪاربن ڊاءِ آڪسائيڊ کي درست ڪري سگهن ٿا، هائيڊروجن پيدا ڪري سگهن ٿا، ۽ خوشبودار مرکبات کي خراب ڪري سگهن ٿا (1-3). انهن عملن لاءِ توانائي فراهم ڪرڻ لاءِ، روشني کي جلدي ۽ موثر طريقي سان ڪيميائي توانائي ۾ تبديل ڪرڻ گهرجي. هي عمل تڏهن شروع ٿئي ٿو جڏهن روشني کي ڇڪڻ وارو اينٽينا ڪمپليڪس روشني کي جذب ڪري ٿو ۽ ڦاسي توانائي کي رد عمل مرڪز (RC) ڏانهن منتقل ڪري ٿو، ان ڪري چارج الڳ ڪرڻ شروع ٿئي ٿو (4 - 7). جامني فوٽو ٽروفڪ بيڪٽيريا ۾ فوٽو سنٿيسس جو بنيادي يونٽ قسم 2 RC تي مشتمل آهي، جيڪو روشني جي فصل جي ڪمپليڪس 1 (LH1) سان گھريل آهي، جيڪو RC-LH1 ڪور ڪمپليڪس ٺاهيندو آهي. LH1 وکر αβ هيٽروڊائمرز جي هڪ صف سان ٺهيل آهي، جن مان هر هڪ ٻه بيڪٽيريا ڪلوروفيل (BChl) هڪ ماليڪيول ۽ هڪ يا ٻه ڪيروٽينائيڊ (8-12) کي ڳنڍي ٿو. سڀ کان سادو LH1 اينٽينا 16 يا 17 αβ هيٽروڊيمر تي مشتمل آهي جيڪي RC (9-13) کي بند لوپ ۾ گهيرو ڪن ٿا، پر ٻين ڪور ڪمپليڪس ۾، ٽرانسميمبرين پيپٽائڊس چوڌاري LH1 جي تسلسل کي روڪيندا آهن، ان ڪري RC ۽ سائٽو ڪروم bc1 ڪمپليڪس (11، 13-15) جي وچ ۾ ڪوئنول/ڪوئنون پکيڙ کي فروغ ڏين ٿا. جامني ڦوٽوٽروفڪ پلانٽ روڊوپسوڊوموناس (Rps.) هڪ ماڊل آرگنزم آهي جيڪو توانائي ۽ اليڪٽران جي منتقلي کي سمجهي سگهي ٿو جيڪو فوٽو سنٿيسس کي سپورٽ ڪري ٿو. Rps جو پهريون ڪرسٽل structure. پالسٽريس RC-LH1 ڪمپليڪس جو ماڊل RC آهي، جيڪو 15 هيٽروڊيميرڪ LH1 لوپس سان گھريل آهي، جيڪي "پروٽين W" (14) نالي هڪ نامعلوم پروٽين سان مداخلت ڪن ٿا. پروٽين-W کي بعد ۾ RPA4402 جي طور تي سڃاڻپ ڪئي وئي، جيڪا هڪ غير نمايان 10.5kDa پروٽين آهي جنهن ۾ ٽي پيشنگوئي ٿيل ٽرانسميمبرين هيلائسز (TMH) (16) آهن. اسان تجويز ڪريون ٿا ته rpa4402 جين انڪوڊنگ پروٽين W جو نالو تبديل ڪري pufW رکيو وڃي ته جيئن RC-L، M (pufL، pufM) ۽ LH1α، β (pufA، pufB) سب يونٽس کي انڪوڊنگ ڪرڻ واري جين لاءِ استعمال ٿيندڙ نالي سان مطابقت رکي سگهجي. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، پروٽين-W صرف RC-LH1 جي لڳ ڀڳ 10٪ ۾ موجود آهي، جيڪو Rps کي ظاهر ڪري ٿو. palustris ٻه مختلف RC-LH1 ڪمپليڪس پيدا ڪري ٿو. هتي، اسان ٻن ڪور ڪمپليڪس جي هاءِ ريزوليوشن ڪرائو-EM (ڪرائو-EM) ڍانچي جي رپورٽ ڪريون ٿا، هڪ پروٽين W ۽ 14 αβ هيٽروڊائمرز سان، ٻيو پروٽين W کان سواءِ ۽ هڪ بند 16 هيٽروڊائمر LH1 لوپ. اسان جي جوڙجڪ Rps. palustris جي RC-LH1 ڪمپليڪس جي سمجھ ۾ هڪ قدم تبديلي جي نمائندگي ڪري ٿي، ڇاڪاڻ ته اسان هر قسم جي هڪجهڙائي آبادي جو تجزيو ڪيو آهي ۽ هر پيپٽائڊ ۽ پابند رنگن ۽ لاڳاپيل لپڊس ۽ ڪوئنونز کي واضح طور تي تفويض ڪرڻ لاءِ ڪافي ريزوليوشن آهي. انهن بناوتن جي مقابلي مان ظاهر ٿئي ٿو ته ٽي TMH پروٽين-W جيڪي اڃا تائين ڪنهن ٻئي RC-LH1 ڪمپليڪس ۾ نه مليا آهن، ڪوئنون/ڪوئنون جي مٽاسٽا کي تيز ڪرڻ لاءِ ڪوئنون چينل پيدا ڪن ٿا. محفوظ ٿيل لپڊ ۽ ڪوئنون جي بندش وارين سائيٽن جي هڪ انگ جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي، ۽ اسان ڪوئنون ۽ RC جي ميلاپ کان پوءِ هڪ نئين ترتيب واري تبديلي ظاهر ڪئي آهي، جيڪا آڪسيجن ٿيل فوٽوٽروفڪ جاندارن جي فوٽو سسٽم II (PSII) RC لاءِ مناسب ٿي سگهي ٿي. اسان جا نتيجا جامني فوٽوٽروفڪ بيڪٽيريا جي RC-LH1 ڪور ڪمپليڪس ۾ ڪوئنون/ڪوئنون جي بندش ۽ مٽاسٽا جي حرڪيات ۾ نئين بصيرت فراهم ڪن ٿا.
Rps. palustris ۾ مليل ٻن ڪمپليڪس جي تفصيلي مطالعي کي آسان بڻائڻ لاءِ، اسان هر RC-LH1 کي بايو ڪيميڪل طريقن سان الڳ ڪريون ٿا. پروٽين W-گهٽت وارو ڪمپليڪس (جنهن کي بعد ۾ ΔpufW سڏيو ويندو آهي) کي pufW جين جي کوٽ واري اسٽرين کان پاڪ ڪيو ويو (16)، ۽ صرف هڪ RC-LH1 ڪمپليڪس پيدا ڪري سگهجي ٿو. پروٽين W-گهٽت وارو ڪمپليڪس هڪ اسٽرين ذريعي پيدا ڪيو ويندو آهي. هن اسٽرين جي پروٽين W کي ان جي C-ٽرمينس تي 10x His ٽيگ سان تبديل ڪيو ويندو آهي، ته جيئن پروٽين W-گهٽت وارو ڪمپليڪس کي مؤثر طريقي سان ڌاتو کي متحرڪ ڪندي سڀ کان وڌيڪ گهٽتائي واري پروٽين W سان ملائي سگهجي. ڪمپليڪس کي مؤثر طريقي سان الڳ ڪيو ويو آهي (16) افينٽي ڪروميٽوگرافي (IMAC).
جيئن شڪل 1 ۾ ڏيکاريل آهي، ٻنهي ڪمپليڪس ۾ ٽي ذيلي يونٽ RC (RC-L، RC-M ۽ RC-H) شامل آهن جيڪي هڪ LH1 اينٽينا سان گھريل آهن. پروٽين-W جي کوٽ واري ڪمپليڪس جي 2.80-A جوڙجڪ 16 αβ هيٽروڊيمر ڏيکاري ٿي، هڪ بند LH1 لوپ ٺاهيندي جيڪا مڪمل طور تي RC جي چوڌاري آهي، جنهن کي بعد ۾ RC-LH116 ڪمپليڪس سڏيو ويندو. پروٽين-W تي مشتمل ڪمپليڪس جي 2.65Å جوڙجڪ ۾ هڪ 14-هيٽروڊيمر LH1 آهي جيڪو پروٽين-W پاران مداخلت ڪئي وئي آهي، جنهن کي بعد ۾ RC-LH114-W سڏيو ويندو.
(الف ۽ ب) مرڪب جي مٿاڇري جي نمائندگي. (سي ۽ ڊي) ڇڙن ۾ ظاهر ڪيل بند ٿيل رنگ. (اي ۽ ايف) سائيٽوپلاسمڪ مٿاڇري مان مشاهدو ڪيل ڪمپليڪس ۾ پيپٽائڊس ۽ LH1 سب يونٽ ڪارٽون ۾ نمائندگي ڪن ٿا، ۽ پروٽين-W گيپ مان گھڙيال جي طرف نمبر ڪيا ويا آهن [Rba نمبرنگ سان مطابقت رکندڙ. اسفيروائيڊس ڪمپليڪس (13)]. LH1-α لاءِ، پروٽين سب يونٽ جو رنگ پيلو آهي؛ LH1-β لاءِ، پروٽين سب يونٽ جو رنگ نيرو آهي؛ پروٽين-W لاءِ، پروٽين ڳاڙهو آهي؛ RC-H لاءِ، اهو سائان آهي؛ RC-L لاءِ، اهو نارنگي آهي؛ RC-M لاءِ، ميجنٽا. ڪوفيڪٽرز ڇڙن جي نمائندگي ڪن ٿا، سائو BChl ۽ BPh a ماليڪيول جي نمائندگي ڪري ٿو، جامني ڪيروٽينائيڊ جي نمائندگي ڪري ٿو، ۽ پيلو UQ10 ماليڪيول جي نمائندگي ڪري ٿو. (G ۽ H) RC-LH114-W ڪمپليڪس (G) ۽ RC-LH116 ڪمپليڪس (H) جي برابر علائقي ۾ پروٽين-W گيپ جو وڌايل نظارو. ڪوفيڪٽرز کي اسپيس فلنگ جي صورت ۾ ڏيکاريو ويندو آهي، چيليٽيڊ ڪوئنون نيري رنگ ۾ ڏيکاريو ويندو آهي. پروٽين-ڊبليو گيپ کي (G) ۾ نيري ڊيشڊ لائين ذريعي نمايان ڪيو ويندو آهي، ۽ ننڍا سوراخ جتي ڪوئنون/ڪوئنولول LH116 رنگ تي ڦهلجي ٿو، انهن کي (H) ۾ ڪاري ڊيشڊ لائين ذريعي نمايان ڪيو ويندو آهي.
شڪل 1 (A ۽ B) LH1αβ هيٽروڊيمر جي کليل يا بند صفن سان گھريل RC ڏيکاري ٿو، جن مان هر هڪ ٻه BChl ۽ هڪ ڪيروٽينائيڊ کي ڳنڍي ٿو (شڪل 1، C ۽ D). پوئين مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته Rps LH1 ڪمپليڪس آهي. اسپيرولينا زانٿن جي بايوسنٿيٽڪ رستي ۾، انهن نسلن ۾ ڪيروٽينائيڊز جي مخلوط آبادي شامل آهي (17). تنهن هوندي به، اسپيروپيروڪسانٿن غالب ڪيروٽينائيڊ آهي ۽ ان جي کثافت اطمينان بخش آهي. تنهن ڪري، اسان سڀني LH1 بائنڊنگ سائيٽن تي اسپيروڪسانٿن کي ماڊل ڪرڻ جو انتخاب ڪيو. الفا ۽ بيٽا پوليپيپٽائڊس هڪ TMH آهن جن ۾ مختصر جھلي ٻاهرين علائقا آهن (شڪل 1، A، B، E، ۽ F). جيتوڻيڪ C-ٽرمينس تي 17 باقيات جي کثافت جو مشاهدو نه ڪيو ويو، الفا پوليپيپٽائڊ ٻنهي ڪمپليڪس ۾ Met1 کان Ala46 تائين ڪٽيو ويو. RC-LH116 ۾ β پولي پيپٽائيڊ کي Gly4 کان Tyr52 تائين گھٽايو ويو، ۽ RC-LH114-W ۾ Ser5 کان Tyr52 تائين. 3 يا 4 N-ٽرمينل يا 13 C-ٽرمينل باقيات جي ڪا به کثافت نه ڏٺي وئي (شڪل S1). جهنگلي قسم جي اسٽرين مان تيار ڪيل مخلوط RC-LH1 ڪمپليڪس جي ماس اسپيڪٽروميٽري تجزيي مان ظاهر ٿيو ته گم ٿيل علائقو انهن پيپٽائڊس جي هيٽرولوگس ڪليويج جو نتيجو هو (شڪل S1 ۽ S2). α-Met1 جي N-ٽرمينل فارميليشن کي پڻ ڏٺو ويو (f). تجزيي مان ظاهر ٿيو ته α-پيپٽائيڊ ۾ fMet1 کان Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 تائين باقيات شامل آهن، ۽ β-پيپٽائيڊ ۾ Ser2 کان Ala53 تائين باقيات شامل آهن، جيڪو گهٽ درجه حرارت EM کثافت نقشي سان سٺي معاهدي ۾ آهي.
α-His29 ۽ β-His36 جي هم آهنگي BChls کي منهن ڏيڻ جو سبب بڻائي ٿي؛ هر αβ هيٽروڊيمر پنهنجي پاڙيسرين سان گڏ هڪ کليل لوپ (RC-LH114-W) يا هڪ بند لوپ (RC-LH116) ٺاهڻ لاءِ گڏ ٿئي ٿو. ايڪسائيٽن ڪپلڊ پگمينٽ ايري (شڪل 1، سي ۽ ڊي). RC-LH114-W جي 877 nm بينڊ جي مقابلي ۾، RC-LH116 جو 880 nm جذب ريڊ شفٽ 3 nm آهي (شڪل 2A). بهرحال، سرڪيولر ڊائڪروزم اسپيڪٽرم تقريبن ساڳيو آهي (شڪل 2B)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته جيتوڻيڪ کليل ۽ بند لوپ جي وچ ۾ واضح فرق آهي، BChls جو مقامي ماحول تمام گهڻو ساڳيو آهي. جذب ريڊ شفٽ گهٽ ٿيل حرارتي حرڪت ۽ بند لوپ تي وڌندڙ استحڪام جو نتيجو ٿي سگهي ٿو (18، 19)، بند لوپ جي ڪري پگمينٽ ڪپلنگ ۾ تبديلي (20، 21)، يا انهن ٻن اثرن جي ميلاپ (11).
(الف) الٽراوائليٽ/نظر ايندڙ/ويجھو انفراريڊ جذب اسپيڪٽرم، جن جي چوٽين کي انهن جي لاڳاپيل رنگن سان نشان لڳايو ويو آهي ۽ 775 nm تي BPh چوٽي تي نارمل ڪيو ويو آهي. (ب) سرڪيولر ڊائڪروزم اسپيڪٽرم 805 nm تي BChl جذب ڏانهن نارمل ڪيو ويو آهي. (سي ۽ ڊي) RC-LH114-W ڪمپليڪس (سي) ۽ RC-LH116 ڪمپليڪس (ڊي) جي وقت-حل ٿيل جذب اسپيڪٽرا مان چونڊيل ΔA اسپيڪٽرا. بهتر مقابلي لاءِ، سڀني اسپيڪٽرا کي 0.2 ps تي ∆A جي ∆A تي نارمل ڪيو ويو آهي. (اي) UQ2 جي مختلف ڪنسنٽريشن جي موجودگي ۾ شعاع کان پوءِ سائٽوڪروم c2 آڪسائيڊشن جي شرح (خام ڊيٽا لاءِ شڪل S8 ڏسو). (ايف) گهٽ، وچولي يا وڏي شدت واري روشني (ترتيب وار 10، 30 يا 300μMm-2 s-1) هيٺ پوکيل سيلن ۾، پروٽين W ۽ RC-L سب يونٽ صاف ٿيل ڪمپليڪس ۽ الڳ ٿيل جھلي جي تناسب ۾. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ۽ immunoassay ذريعي پروٽين جي سطح جو تعين ڪريو (خام ڊيٽا لاءِ شڪل S9 ڏسو). پاڪ ٿيل RC-LH114-W ڪمپليڪس جي نسبت تناسب جو تعين ڪريو. ڪمپليڪس جي پروٽين-W سان RC-L جو اسٽوچيوميٽرڪ تناسب 1:1 آهي.
RC-LH114-W (شڪل 1، A، C، ۽ E) جي خراب ٿيل αβ14 لوپ ۾ پوزيشن 1 تي BChls RC-LH116 (شڪل 1، B، D، ۽ F، ۽ شڪل S3) ۾ برابر BChls جي ڀيٽ ۾ RC پرائمري ڊونر (P) جي 6.8Å ويجهو آهن؛ جڏهن ته، ٻن ڪمپليڪس جي عارضي جذب ڪندڙ حرڪيات ڏيکارين ٿا ته RC-LH114-W ۽ RC-LH116 لاءِ، LH1 کان RC تائين جوش توانائي جي منتقلي وقت جي مستقل 40 ±4 ۽ 44±3 ps آهن (شڪل 2). ، C ۽ D، شڪل S4 ۽ ٽيبل S2). RC اندر اليڪٽرانڪ منتقلي ۾ پڻ ڪو خاص فرق ناهي (شڪل S5 ۽ لاڳاپيل ضمني متن). اسان کي شڪ آهي ته LH1 ۽ RC-P جي وچ ۾ توانائي جي منتقلي وقت جي ويجهي خط و ڪتابت ٻن LH1 لوپس ۾ اڪثر BChl جي ساڳئي فاصلي، زاويه ۽ امڪاني توانائي جي ڪري آهي. اهو لڳي ٿو ته گهٽ ۾ گهٽ فاصلي تائين پهچڻ لاءِ LH1 توانائي جي نموني کي ڳولڻ، گهٽ ۾ گهٽ فاصلي تائين پهچڻ لاءِ، گهٽ ۾ گهٽ سائيٽن کان RC ڏانهن سڌي توانائي جي منتقلي کان تيز نه آهي. RC-LH114-W ۾ اوپن-لوپ LH1 لوپ پڻ ساخت جي تجزيي لاءِ گهٽ درجه حرارت جي حالتن هيٺ غير معمولي حرارتي حرڪت مان گذري سگهي ٿو، ۽ RC 1 جي پوزيشن تي βBChls جي رنگ جي فاصلي کان ڪمري جي حرارت تي هڪ ڊگهو αβ14 رنگ ڪنفارميشن آهي.
RC-LH116 ڪمپليڪس ۾ 32 BChls ۽ 16 ڪيروٽينائيڊ شامل آهن، ۽ ان جو مجموعي انتظام ساڳيو آهي جيڪو Thermochromatium (Tch.) pidpidum [پروٽين ڊيٽا بينڪ (PDB) ID 5Y5S] (9)، Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) ۽ سائي الجي (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) مان حاصل ڪيو ويو آهي. ترتيب ڏيڻ کان پوءِ، αβ heterodimers جي پوزيشن ۾ صرف ننڍا انحراف ڏٺا ويا، خاص طور تي 1-5، 15، ۽ 16 (شڪل S6). پروٽين-W جي موجودگي LH1 جي جوڙجڪ تي هڪ اهم اثر وجهي ٿي. ان جا ٽي TMH مختصر لوپس سان ڳنڍيل آهن، N-ٽرمينل ڪمپليڪس جي لومن پاسي ۽ C-ٽرمينل سائيٽوپلاسمڪ پاسي (شڪل 1A ۽ 3، A کان D). پروٽين-ڊبليو گهڻو ڪري هائيڊروفوبڪ آهي (شڪل 3B)، ۽ TMH2 ۽ TMH3 LH1αβ-14 سان رابطو ڪري هڪ ٽرانسميمبرين مٿاڇري ٺاهيندا آهن (شڪل 3، B ۽ E کان G). انٽرفيس بنيادي طور تي ٽرانسميمبرين علائقي ۾ Phe، Leu ۽ Val جي باقيات تي مشتمل آهي. اهي باقيات هائيڊروفوبڪ امينو ايسڊ ۽ αβ-14 رنگن سان ڀريل آهن. ڪجهه قطبي باقيات پڻ رابطي ۾ حصو وٺندا آهن، جنهن ۾ پيچيده گفا جي مٿاڇري تي W-Thr68 ۽ β-Trp42 جي وچ ۾ هائيڊروجن بانڊ شامل آهي (شڪل 3، F ۽ G). سائيٽوپلازم جي مٿاڇري تي، Gln34 αβ-14 ڪيروٽينائيڊز جي ڪيٽو گروپ سان ڳنڍيل آهي. ان کان علاوه، n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ماليڪيول حل ڪيو ويو، ۽ ان جي هائيڊروفوبڪ دم پروٽين-ڊبليو ۽ αβ-14 جي وچ ۾ انٽرفيس تائين وڌايو ويو، ۽ لپڊ دم جسم ۾ واقع ٿي سگهي ٿو. اسان اهو پڻ ڏٺو ته پروٽين W ۽ RCH جا C-ٽرمينل ريزوليوشن علائقا تمام ويجهو آهن، پر مخصوص رابطي جي جوڙجڪ جي دائري ۾ نه آهن (شڪل 1، A ۽ E). جڏهن ته، انهن ٻن پروٽينن جي حل نه ٿيل C-ٽرمينل امينو ايسڊز ۾ رابطي ٿي سگهي ٿي، جيڪا RC-LH114-W ڪمپليڪس جي اسيمبلي دوران پروٽين-W جي ڀرتي لاءِ هڪ طريقو مهيا ڪري سگهي ٿي.
(الف) پروٽين-ڊبليو، جيڪو ڪارٽون جي صورت ۾ LH1αβ14 سان انٽرفيس کي منهن ڏئي ٿو، ان ۾ هڪ راڊ جي شڪل واري پاسي واري زنجير (ڳاڙهو) آهي، جيڪا اليڪٽرو اسٽيٽڪ پوٽينشل ڊاگرام جي هڪ حصي ۾ ڏيکاريل آهي (0.13 جي ڪنٽور ليول سان شفاف گرين مٿاڇري). (ب) پروٽين-ڊبليو هڪ هائيڊروفوبڪ رنگ جي مٿاڇري سان نمائندگي ڪري ٿو. پولر ۽ چارج ٿيل علائقا سائان ۾ ڏيکاريا ويا آهن، هائيڊروفوبڪ علائقا اڇي ۾ ڏيکاريا ويا آهن، ۽ مضبوط هائيڊروفوبڪ علائقا نارنگي ۾ ڏيکاريا ويا آهن. (سي ۽ ڊي) ڪارٽون ۾ پروٽين-ڊبليو جي نمائندگي ڪئي وئي آهي، ان جو رخ (اي) (سي) ۾ ساڳيو آهي، ۽ 180° (ڊي) پاران گھمايو ويو آهي. ترتيب ۾ پوزيشن جي مطابق، فرق ڪرڻ وارا باقيات هڪ قوس قزح رنگ جي اسڪيم اختيار ڪن ٿا، جتي اين ٽرمينل نيرو آهي ۽ سي ٽرمينل ڳاڙهو آهي. (اي) پروٽين-ڊبليو ساڳئي نظر ۾ (اي) ۾، ۽ پروٽين-ڊبليو: ايل ايڇ 1 جي انٽرفيس تي باقيات منسلڪ نشانن سان راڊز سان نمائندگي ڪن ٿا. (F) ڪارٽون نمائندگي ۾ پروٽين-W کي (E) ۽ LH1αβ14 جي نسبت سان 90° گھمايو ويو آهي، ۽ بار نمائندگي ۾ انٽرفيس باقيات جي نسبت سان. بيٽا پولي پيپٽائيڊ مان اوور هينگنگ باقيات کي ليبل ڪيو ويو آهي. ڪوفيڪٽر کي شڪل 1 جي رنگ سان ملندڙ بار جي طور تي ڏيکاريو ويو آهي، سڙيل β-DDM کي گرين رنگ ۾ ڏيکاريو ويو آهي، ۽ آڪسيجن ڳاڙهي رنگ ۾ ڏيکاريو ويو آهي. (G) (F) ۾ نظارو 180° گھمايو ويو آهي، ليبل ٿيل الفا پولي پيپٽائيڊ جي نمايان باقيات سان.
پروٽين-ڊبليو هڪ αβ هيٽروڊيمر (شڪل 1F ۾ 15 هون) کي تبديل ڪري ٿو، ان ڪري لوپ بند ٿيڻ کان روڪي ٿو ۽ پهرين ٽن αβ هيٽروڊيمر کي جھڪائيندو آهي. اهو ڏٺو ويو ته پهرين αβ-1 هيٽروڊيمر جو وڌ ۾ وڌ جھڪاءُ جو زاويه فلم نارمل جي نسبت 25° کان 29° هو (شڪل 1، A ۽ E)، جيڪو RC A تيز برعڪس-LH116 (شڪل 1، B ۽ F) ۾ αβ-1 جي 2° کان 8° جھڪاءُ سان ٺهيل هو. ٻيو ۽ ٽيون هيٽروڊيمر ترتيب وار 12° کان 22° ۽ 5° کان 10° تي جھڪيل آهن. RC جي اسٽيرڪ رڪاوٽ جي ڪري، αβ-1 جي جھڪاءُ ۾ αβ جو ٻيو جوڙو شامل ناهي (جيڪو شڪل 1F ۾ 16هين αβ سان ملندو آهي)، اهڙي طرح LH1 رنگ ۾ هڪ واضح فرق پيدا ٿئي ٿو (شڪل 1، A ۽ E). ٻن αβ هيٽروڊيمر جي کوٽ جي ڪري، چار BChl ۽ ٻن ڪيروٽينائيڊز جي نقصان سان گڏ، ڪو به ڪيروٽينائيڊ ٽوڙيل αβ-1 سب يونٽ سان نه جڙيل آهي، جنهن جي نتيجي ۾ هڪ LH114-W رنگ پيدا ٿئي ٿو جنهن ۾ 13 ڪيروٽينائيڊز سبزي خور ۽ 28 BChl آهن. αβ1 کان 7 علائقن ۾ ٻن ڪمپليڪس جي مقامي ريزوليوشن اندازي باقي LH1 لوپ جي ڀيٽ ۾ گهٽ آهي، جيڪا RC QB سائيٽ (شڪل 4) سان ملحق LH1 سب يونٽ جي موروثي پلاسٽيسٽي کي ظاهر ڪري سگهي ٿي.
RC-LH114-W (A ۽ B) ۽ RC-LH116 (C ۽ D) جون تصويرون ساڳئي مٿئين ڏيک/پاسي واري ڏيک (A ۽ B) (A ۽ C) ۽ تصوير 1. (B ۽ D) جي گفا جي مٿاڇري مان ڏيکاريل آهن. رنگين چاٻيون ساڄي پاسي ڏيکاريل آهن.
1:14 جي اسٽوچيوميٽرڪ تناسب سان واحد ٻيو خاصيت وارو ڪور ڪمپليڪس روڊوڪوڪس اسفائرائڊس (Rba.) RC-LH1-PufX ڊائمر (13) آهي. بهرحال، پروٽين W ۽ PufX جو ڪو به واضح هم آهنگي ناهي، ۽ انهن جو انهن جي لاڳاپيل LH1 ڍانچي تي هڪ اهم اثر آهي. PufX هڪ واحد TMH آهي جنهن ۾ هڪ N-ٽرمينل سائيٽوپلاسمڪ ڊومين آهي جيڪو Rps. palustris LH116αβ-16 سان لاڳاپيل پوزيشن تي RC-H سب يونٽ (13) جي سائيٽوپلاسمڪ پاسي سان رابطو ڪري ٿو. PufX RC-LH1 ۽ سائيٽو ڪروم bcl ڪمپليڪس جي وچ ۾ ڪوئنون/ڪوئنولون جي تبادلي لاءِ هڪ چينل ٺاهي ٿو ۽ سڀني Rba. sphaeroides ڪور ڪمپليڪس (13) ۾ موجود آهي. جيتوڻيڪ مونومر-مونومر انٽرفيس Rba ۾ آهي. اسفيروائيڊس RC-LH1-PufX ڊائمر RC-LH114-W ۾ پروٽين W جي پابند پوزيشن تي واقع آهي، ۽ PufX ۽ پروٽين-W پاران پيدا ڪيل خال هڪ برابر پوزيشن تي آهي (شڪل S7A). RC-LH114-W ۾ خال پڻ Pseudomonas rosea LH1 جي فرضي ڪوئنون چينل (8) سان ترتيب ڏنل آهي، جيڪو پروٽين W يا PufX (شڪل S7B) سان لاڳاپيل نه پيپٽائڊس ذريعي ٺهيل آهي. ان کان علاوه، Blc ۾ ڪوئنون چينل. هڪ γ سب يونٽ (7) کي خارج ڪندي ٺهيل زمرد سائو LH1 هڪجهڙي پوزيشن ۾ واقع آهي (شڪل S7C). جيتوڻيڪ مختلف پروٽينن جي وچ ۾، RC-LH1 ڪمپليڪس ۾ هڪ عام پوزيشن ۾ انهن ڪوئنون/ڪوئنولول چينلن جو ظاهر ٿيڻ ڪنورجنٽ ارتقا جي هڪ مثال لڳي ٿو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته پروٽين W پاران پيدا ڪيل خال ڪوئنون چينل طور ڪم ڪري سگهي ٿو.
LH114-W لوپ ۾ فرق RC-LH114-W ڪمپليڪس جي اندروني جاءِ ۽ بلڪ جھلي (شڪل 1G) جي وچ ۾ هڪ مسلسل جھلي واري علائقي جي ٺهڻ جي اجازت ڏئي ٿو، پروٽين جي طور تي پروٽين جي سوراخ ذريعي ٻن ڊومينز کي ڳنڍڻ جي بدران. RC-LH116 ڪمپليڪس هڪ بند Tch وانگر آهي. سوئي جهڙو ڪمپليڪس (22) (شڪل 1H). جيئن ته جھلي ذريعي ڪوئنون جو ڦهلاءُ تنگ پروٽين چينل ذريعي ڦهلاءُ کان تيز آهي، کليل LH114-W لوپ بند LH116 لوپ جي ڀيٽ ۾ تيز RC ٽرن اوور جي اجازت ڏئي سگهي ٿو، ۽ RC ۾ ڪوئنون جو ڦهلاءُ وڌيڪ محدود ٿي سگهي ٿو. اهو جانچڻ لاءِ ته ڇا پروٽين W RC ذريعي ڪوئنون جي تبديلي کي متاثر ڪري ٿو، اسان ubiquinone 2 (UQ2) جي هڪ خاص ڪنسنٽريشن (قدرتي UQ10 جو هڪ اينالاگ هڪ ننڍڙي آئسوپرين دم سان) (شڪل 2E) تي هڪ سائيٽو ڪروم آڪسائيڊيشن ايسي ڪئي. جيتوڻيڪ چيليٽيڊ ڪوئنون جي موجودگي ظاهري مائيڪلس ڪانسٽنٽ جي صحيح تعين ۾ رڪاوٽ بڻجي ٿي (RC-LH114-W ۽ RC-LH116 ترتيب وار 0.2±0.1μM ۽ 0.5±0.2μM لاءِ موزون آهن)، RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) جي وڌ ۾ وڌ شرح RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) کان 28±5% وڏي آهي.
اسان شروعاتي طور تي اندازو لڳايو ته پروٽين-W ڪور ڪمپليڪس جي لڳ ڀڳ 10٪ ۾ موجود آهي (16)؛ هتي، گهٽ روشني، وچولي روشني، ۽ تيز روشني جي واڌ جي سيلز جي قبضي جي شرح 15±0.6٪، 11±1٪ ۽ 0.9±0.5 آهي، ترتيب وار % (شڪل 2F). ماس اسپيڪٽروميٽري جي مقداري مقابلي مان ظاهر ٿيو ته هسٽيڊائن ٽيگ جي اضافي سان جهنگلي قسم جي اسٽرين (P = 0.59) جي مقابلي ۾ پروٽين-W جي نسبتي ڪثرت گهٽ نه ٿي، تنهن ڪري اهي سطحون تبديل ٿيل پروٽين-W (شڪل S10) جو نمونو نه آهن. تاهم، RC-LH1 ڪمپليڪس ۾ پروٽين-W جي هي گهٽ قبضي ڪجهه RCs کي تيز رفتار تي فلپ ڪرڻ جي اجازت ڏئي سگهي ٿي، انهي ڪري RC-LH116 ڪمپليڪس ۾ سست ڪوئنون/ڪوئنولون ايڪسچينج کي گهٽائي سگهجي ٿو. اسان ڏٺو ته تيز روشني جي قبضي جي شرح تازي ٽرانسڪرپٽوميڪس ڊيٽا سان مطابقت نٿي رکي، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته مضبوط روشني هيٺ pufW جين جو اظهار وڌي ٿو (شڪل S11) (23). pufW ٽرانسڪرپشن ۽ RC-LH1 ڪمپليڪس ۾ پروٽين-W جي شموليت جي وچ ۾ فرق مونجهارو آهي ۽ پروٽين جي پيچيده ضابطي کي ظاهر ڪري سگهي ٿو.
RC-LH114-W ۾، 6 ڪارڊيو لپين (CDL)، 7 فاسفيٽائيڊلڪولين (POPC)، 1 فاسفيٽائيڊلگليسرول (POPG) ۽ 29 β-DDM ماليڪيول مختص ڪيا ويا آهن ۽ ان ۾ ماڊل ڪيا ويا آهن 6 CDLs، 24 POPCs، 2 POPGs ۽ 12 βDDMs. RC-LH116 (شڪل 5، A ۽ B). انهن ٻن بناوتن ۾، CDL تقريبن ڪمپليڪس جي سائيٽوپلاسمڪ پاسي تي واقع آهي، جڏهن ته POPC، POPG ۽ β-DDM گهڻو ڪري لومينل پاسي تي واقع آهن. ٻه لپڊ ۽ ڊٽرجنٽ ماليڪيول RC-LH114-W ڪمپليڪس (شڪل 5A) جي αβ-1 کان αβ-6 علائقي ۾ الڳ ڪيا ويا، ۽ پنج RC-LH116 (شڪل 5B) جي برابر علائقي ۾ الڳ ڪيا ويا. ڪمپليڪس جي ٻئي پاسي وڌيڪ لپڊ مليا، خاص طور تي CDL، جيڪي RC ۽ αβ-7 کان αβ-13 جي وچ ۾ جمع ٿيا (شڪل 5، A ۽ B). ٻيا ساختي طور تي حل ٿيل لپڊ ۽ ڊٽرجنٽ LH1 رنگ کان ٻاهر واقع آهن، ۽ چڱي طرح حل ٿيل ايسل زنجير LH1 سب يونٽن جي وچ ۾ وڌندا آهن، عارضي طور تي RC-LH114-W ۾ β-DDM طور نامزد ڪيا ويا آهن، ۽ RC ۾ β-DDM طور بيان ڪيا ويا آهن β-DDM ۽ POPC-LH116 جو مرکب. اسان جي جوڙجڪ ۾ چيليٽنگ لپڊ ۽ ڊٽرجنٽ جون ساڳيون پوزيشنون ظاهر ڪن ٿيون ته اهي جسماني طور تي لاڳاپيل پابند سائيٽون آهن (شڪل S12A). Tch ۾ برابر ماليڪيولن جي پوزيشن ۾ پڻ سٺي مستقل مزاجي آهي. نرم ۽ Trv. اسٽرين 970 RC-LH1s (شڪل S12، B کان E) (9، 12) ۽ لپڊ هيڊ گروپ جي هائيڊروجن-بانڊنگ باقيات ترتيب جي ترتيب (شڪل S13) ۾ ڪافي سٺي تحفظ ڏيکاريو، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته محفوظ ڪيل CDL جيڪو RC (24) سان ڳنڍيل آهي، اهي سائيٽون RC-LH1 ڪمپليڪس ۾ محفوظ ٿي سگهن ٿيون.
(A ۽ B) RC-LH114-W (A) ۽ RC-LH116 (B) پيپٽائڊس ڪارٽون ذريعي ڏيکاريا ويا آهن، ۽ رنگن کي راڊز ذريعي ڏيکاريا ويا آهن، شڪل 1 ۾ رنگ اسڪيم استعمال ڪندي. لپڊس ڳاڙهي رنگ ۾ ڏيکاريا ويا آهن، ۽ ڊٽرجنٽ گرين رنگ ۾ ڏيکاريا ويا آهن. RC QA ۽ QB سائيٽن سان ڳنڍيل UQ پيلو آهي، جڏهن ته الڳ ٿيل UQ نيرو آهي. (C ۽ D) ساڳيا نظارا (A) ۽ (B)، لپڊس کي ڇڏي ڏنو ويو آهي. (E کان G) RC-LH116 کان Q1(E)، Q2(F) ۽ Q3(G) جو وڏو نظارو، هڪ ٻئي تي اثر انداز ٿيندڙ پاسي واري زنجيرن سان. هائيڊروجن بانڊ ڪاري ڊيشڊ لائينن جي طور تي ڏيکاريا ويا آهن.
RC-LH116 ۾، ٻئي RC QA ۽ QB UQ، جيڪي چارج سيپريشن جي عمل ۾ اليڪٽران جي منتقلي ۾ حصو وٺندا آهن، انهن جي پابند جڳهن ۾ ڊهي ويندا آهن. جڏهن ته، RC-LH114-W ۾، QB ڪوئنون حل نه ڪيو ويو آهي ۽ هيٺ تفصيل سان بحث ڪيو ويندو. QA ۽ QB ڪوئنون کان علاوه، ٻه چيليٽيڊ UQ ماليڪيول (RC ۽ LH1 رِنگز جي وچ ۾ واقع) RC-LH114-W جي جوڙجڪ ۾ انهن جي چڱي طرح حل ٿيل هيڊ گروپن (ترتيب وار Q1 ۽ Q2 ۾ واقع) جي مطابق مختص ڪيا ويا آهن. خلا). شڪل 5C). ٻه آئسوپرين يونٽ Q1 کي تفويض ڪيا ويا آهن، ۽ کثافت جو نقشو Q2 جي مڪمل 10 آئسوپرين ٽيلز کي حل ڪري ٿو. RC-LH116 جي جوڙجڪ ۾، ٽي چيليٽيڊ UQ10 ماليڪيول (Q1 کان Q3، شڪل 5D) حل ڪيا ويا، ۽ سڀني ماليڪيولن جي پوري دم ۾ هڪ واضح کثافت آهي (شڪل 5، D کان G). ٻنھي جوڙجڪ ۾، Q1 ۽ Q2 جي ڪوئنون هيڊ گروپن جي پوزيشن ۾ شاندار مستقل مزاجي آهي (شڪل S12F)، ۽ اهي صرف RC سان رابطو ڪن ٿا. Q1 RC-LH114-W (شڪل 1G ۽ 5، C، D ۽ E) جي W گپ جي داخلا تي واقع آهي، ۽ Q2 QB بائنڊنگ سائيٽ (شڪل 5، C، D) ۽ F جي ويجهو واقع آهي. محفوظ ڪيل L-Trp143 ۽ L-Trp269 باقيات Q1 ۽ Q2 جي تمام ويجهو آهن ۽ امڪاني π-اسٽيڪنگ رابطي فراهم ڪن ٿا (شڪل 5، E ۽ F، ۽ شڪل S12). Q1 جي ڊسٽل آڪسيجن مان L-Gln88، 3.0 Å، هڪ مضبوط هائيڊروجن بانڊ فراهم ڪري ٿو (شڪل 5E)؛ هي باقيات سڀني RCs ۾ محفوظ آهي سواءِ سڀ کان وڌيڪ پري تعلق (شڪل S13) جي. L-Ser91 کي ٻين RCs (شڪل S13) ۾ Thr جي بدران قدامت پسند طور تي متبادل بڻايو ويو آهي، Q1 جي ميٿائل آڪسيجن مان 3.8 اينگسٽروم آهي، ۽ ڪمزور هائيڊروجن بانڊ مهيا ڪري سگهي ٿو (شڪل 5E). Q3 ۾ ڪو خاص رابطو نظر نٿو اچي، پر اهو RC-M سب يونٽ ۽ LH1-α سب يونٽ 5 کان 6 (شڪل 5، D ۽ G) جي وچ ۾ هائيڊروفوبڪ علائقي ۾ واقع آهي. Q1، Q2 ۽ Q3 يا ويجهي چيليٽيڊ ڪوئنون پڻ Tch. Gentle، Trv. Strain 970 ۽ Blc ۾ حل ڪيا ويا آهن. آئرس جي جوڙجڪ (9، 10، 12) RC-LH1 ڪمپليڪس (شڪل S12G) ۾ هڪ محفوظ معاون ڪوئنون بائنڊنگ سائيٽ ڏانهن اشارو ڪري ٿي. RC-LH116 ۾ پنج ڊوميسز ٿيل UQs هر ڪمپليڪس جي 5.8±0.7 سان سٺي معاهدي ۾ آهن جيڪي اعليٰ ڪارڪردگي واري مائع ڪروميٽوگرافي (HPLC) پاران طئي ڪيا ويا آهن، جڏهن ته RC-LH114-W ۾ ٽي ڊوميسز ٿيل UQs 6.2±0.3 جي ماپيل قدر کان گهٽ آهن (شڪل S14) ظاهر ڪري ٿو ته ساخت ۾ حل نه ٿيل UQ ماليڪيول آهن.
سيوڊو-سميٽرڪ ايل ۽ ايم پوليپيپٽائڊس هر هڪ ۾ پنج TMHs هوندا آهن ۽ هڪ هيٽروڊيمر ٺاهيندا آهن جيڪو هڪ BChl ڊائمر، ٻه BChl مونومر، ٻه بيڪٽيريوفيج (BPh) مونومر، ۽ هڪ غير هيم آئرن ۽ هڪ يا ٻه UQ10 ماليڪيولز کي گڏ ڪري ٿو. ٽرمينل ڪيٽون گروپ تي هائيڊروجن بانڊ جي موجودگي ۽ Rps ۾ ان جي سڃاتل جمع جي ذريعي، ڪيروٽينائيڊز M-subunit ۾ شامل ڪيا ويا آهن، جنهن کي cis-3,4-dehydroorhodopin جو نالو ڏنو ويو آهي. جنسون (25). RC-H جو ٻاهرين جھلي ڊومين هڪ واحد TMH ذريعي جھلي سان لنگر انداز ٿئي ٿو. مجموعي طور تي RC structure لاڳاپيل نسلن جي ٽن سب يونٽ RC (جهڙوڪ Rba) سان ملندڙ جلندڙ آهي. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl ۽ BPh جا ميڪرو سائيڪل، ڪيروٽينائيڊ بيڪ بون ۽ نان هيم آئرن انهن ڍانچن جي ريزوليوشن رينج اندر اوورليپ ٿين ٿا، جيئن QA سائيٽ تي UQ10 هيڊ گروپ ۽ RC-LH116 تي QB ڪوئنون (شڪل S15).
مختلف QB سائيٽ جي قبضي جي شرحن سان ٻن RC structures جي دستيابي QB quinone بائنڊنگ سان گڏ مسلسل conformational تبديلين جي جانچ ڪرڻ جو هڪ نئون موقعو فراهم ڪري ٿي. RC-LH116 ڪمپليڪس ۾، QB quinone مڪمل طور تي پابند "قريب" پوزيشن ۾ واقع آهي (26)، پر RC-LH114-W جي علحدگي ۾ QB quinone ناهي. RC-LH114-W ۾ ڪو به QB quinone ناهي، جيڪو حيرت انگيز آهي ڇاڪاڻ ته ڪمپليڪس فعال آهي، RC-LH116 ڪمپليڪس کان وڌيڪ ساختي طور تي حل ٿيل QB quinone سان. جيتوڻيڪ ٻه LH1 رِنگ تقريباً ڇهه quinone چيليٽ ڪن ٿا، پنج بند RC-LH116 رِنگ ۾ ساختي طور تي حل ٿيل آهن، جڏهن ته صرف ٽي کليل RC-LH114-W رِنگ ۾ ساختي طور تي محدود آهن. هي وڌندڙ ساخت جي خرابي شايد RC-LH114-W QB سائيٽن جي تيز متبادل، ڪمپليڪس ۾ تيز ڪوئنون ڪينيٽڪس، ۽ LH1 لوپ کي پار ڪرڻ جي وڌندڙ امڪان کي ظاهر ڪري سگهي ٿي. اسان جو مشورو آهي ته RC-LH114-W جي RC QB سائيٽ ۾ UQ جي کوٽ هڪ وڌيڪ پيچيده ۽ وڌيڪ فعال ڪمپليڪس جو نتيجو ٿي سگهي ٿي، ۽ RC-LH114-W جي QB سائيٽ کي فوري طور تي UQ ٽرن اوور ۾ منجمد ڪيو ويو آهي. مخصوص اسٽيج (QB سائيٽ جو داخلا بند ڪيو ويو آهي) هن سرگرمي جي ترتيب کي ظاهر ڪري ٿو.
QB کان سواءِ، L-Phe217 جي گردش سان گڏ هڪ اهڙي پوزيشن تي جيڪا UQ10 بائنڊنگ سان مطابقت نه رکي، ڇاڪاڻ ته اهو دم جي پهرين آئسوپرين يونٽ سان هڪ مقامي ٽڪراءُ جو سبب بڻجندو (شڪل 6A). ان کان علاوه، واضح مکيه ڪنفوميشنل تبديليون واضح آهن، خاص طور تي هيلڪس ڊي (TMH D ۽ E جي وچ ۾ لوپ ۾ ننڍو هيلڪس) جتي L-Phe217 کي QB بائنڊنگ کيسي ڏانهن منتقل ڪيو ويو آهي ۽ L-Tyr223 جي گردش (شڪل 6A) M-Asp45 فريم ورڪ سان هائيڊروجن بانڊ کي ٽوڙڻ ۽ QB بائنڊنگ سائيٽ جي داخلا کي بند ڪرڻ لاءِ (شڪل 6B). هيلڪس ڊي پنهنجي بنياد تي پيوٽ ڪري ٿو، L-Ser209 جو Cα 0.33Å منتقل ڪيو ويو آهي، جڏهن ته L-Val221Cα 3.52Å منتقل ڪيو ويو آهي. TMH D ۽ E ۾ ڪو به مشاهدو ٿيندڙ تبديليون نه آهن، جيڪي ٻنهي جوڙجڪ ۾ سپر امپوزيبل آهن (شڪل 6A). جيتري قدر اسان ڄاڻون ٿا، هي قدرتي آر سي ۾ پهريون ڍانچو آهي جيڪو QB سائيٽ کي بند ڪري ٿو. مڪمل (QB-بائونڊ) ڍانچي سان مقابلو ڏيکاري ٿو ته ڪوئنون کي گهٽائڻ کان اڳ، ان کي ڪوئنون ۾ داخل ڪرڻ لاءِ هڪ ڪنفرميشنل تبديلي جي ضرورت آهي. L-Phe217 ڪوئنون هيڊ گروپ سان π-اسٽيڪنگ رابطي ٺاهڻ لاءِ گھمندو آهي، ۽ هيلڪس ٻاهر منتقل ٿيندو آهي، جنهن سان L-Gly222 جي کنڊر ۽ L-Tyr223 جي پاسي واري زنجير کي هڪ مستحڪم هائيڊروجن بانڊ جوڙجڪ سان هڪ هائيڊروجن بانڊ نيٽ ورڪ ٺاهڻ جي اجازت ملندي آهي (شڪل 6، A ۽ C).
(الف) هولوگرام (ايل زنجير، نارنگي/ايم زنجير، ميجنٽا) ۽ اپو (گرين) ڍانچي جو اوورليپنگ ڪارٽون، جنهن ۾ اهم باقيات هڪ راڊ جهڙي نمائندگي جي صورت ۾ ڏيکاريا ويا آهن. UQ10 هڪ پيلي بار سان ظاهر ڪيو ويو آهي. ڊاٽ ٿيل لڪير پوري ڍانچي ۾ ٺهيل هائيڊروجن بانڊ کي ظاهر ڪري ٿي. (ب ۽ سي) اپوليپوپروٽين ۽ پوري رنگ جي جوڙجڪ جي مٿاڇري جي نمائندگي، ترتيب وار نيري رنگ ۾ L-Phe217 ۽ ڳاڙهي رنگ ۾ L-Tyr223 جي سائڊ چين آڪسيجن کي نمايان ڪندي. L سب يونٽ نارنگي آهي؛ M ۽ H سب يونٽ رنگين نه آهن. (ڊي ۽ اي) اپوليپوپروٽين (ڊي) ۽ سڄو (اي) آر سي ڪي بي سائيٽون [ترتيب وار (اي) رنگ] ۽ ٿرموفيلس ٿرموفيلس PSII (پلاسٽڪ ڪوئنون سان سائو، نيرو؛ PDB ID: 3WU2) ترتيب ڏيو (58).
غير متوقع طور تي، جيتوڻيڪ LH1 کان سواءِ QB جي گهٽتائي واري RCs جون ڪيتريون ئي بناوتون موجود آهن، هن مطالعي ۾ ڏٺل بناوت واري تبديلين جي اڳ ۾ رپورٽ نه ڪئي وئي آهي. انهن ۾ Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27)، Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ۽ Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) مان QB جي گهٽتائي واري بناوت شامل آهي، جيڪي سڀئي انهن جي مجموعي QB بناوت وانگر لڳ ڀڳ ساڳيا آهن. 3PRC جي ويجهي معائني مان ظاهر ٿيو ته LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ڊٽرجنٽ ماليڪيول QB پوزيشن جي داخلا تي جڙيل آهن، جيڪو بند بناوت ۾ ٻيهر ترتيب کي روڪي سگهي ٿو. جيتوڻيڪ LDAO 1EYS يا 1OGV ۾ ساڳئي پوزيشن تي خراب نه ٿيندو آهي، اهي RCs ساڳئي ڊٽرجنٽ استعمال ڪندي تيار ڪيا ويندا آهن ۽ تنهن ڪري ساڳيو اثر پيدا ڪري سگهن ٿا. Rba جي ڪرسٽل بناوت. سائٽو ڪروم c2 (PDB ID: 1L9B) سان گڏ ڪرسٽل ٿيل Sphaeroides RC ۾ پڻ هڪ بند QB سائيٽ نظر اچي ٿي. بهرحال، هن صورت ۾، RC-M پوليپيپٽائيڊ جو N-ٽرمينل علائقو (Q هيلڪس تي Tyr ريزيڊيو جي H بانڊ ذريعي QB بائنڊنگ سائيٽ سان لهه وچڙ ۾) هڪ غير فطري شڪل اختيار ڪري ٿو، ۽ QB ڪنفرميشنل تبديلي کي وڌيڪ نه ڳولهيو ويو آهي (30). اطمينان بخش ڳالهه اها آهي ته اسان RC-LH114-W structure ۾ M پوليپيپٽائيڊ جي هن قسم جي خرابي نه ڏٺي آهي، جيڪا تقريبن RC-LH116 RC جي N-ٽرمينل علائقي وانگر آهي. اهو پڻ ياد رکڻ گهرجي ته ڊٽرجنٽ تي ٻڌل LH1 اينٽينا جي خاتمي کان پوءِ، PDB ۾ اپوليپوپروٽين RCs حل ٿي ويا، جنهن RC ۽ چوڌاري LH1 رنگ جي اندروني سطح جي وچ ۾ خلا ۾ اندروني ڪوئنون پول ۽ لپڊس کي ختم ڪري ڇڏيو (31، 32). آر سي فعال رهي ٿو ڇاڪاڻ ته اهو سڀني ڪوفيڪٽرز کي برقرار رکي ٿو، سواءِ ڊيڪمپوز ايبل QB ڪوئنون جي، جيڪو گهٽ مستحڪم آهي ۽ اڪثر تياري جي عمل دوران گم ٿي ويندو آهي (33). ان کان علاوه، اهو معلوم آهي ته آر سي مان LH1 ۽ قدرتي چڪر واري لپڊس کي هٽائڻ سان ڪمن تي اثر پئجي سگهي ٿو، جهڙوڪ چارج کان الڳ ٿيل P+QB-اسٽيٽ جي مختصر عمر (31، 34، 35). تنهن ڪري، اسان اندازو لڳايو ٿا ته آر سي جي چوڌاري مقامي LH1 رنگ جو وجود "بند" QB سائيٽ کي برقرار رکي سگهي ٿو، انهي ڪري QB جي ويجهو مقامي ماحول کي محفوظ رکي ٿو.
جيتوڻيڪ اپوليپوپروٽين (QB ڪوئنون کان سواءِ) ۽ مڪمل ڍانچو QB سائيٽ جي ٽرن اوور جا صرف ٻه سنيپ شاٽ پيش ڪن ٿا، واقعن جي هڪ سلسلي جي بدران، اهڙا اشارا آهن ته بائنڊنگ کي هائيڊروڪوئنون ذريعي ريبائنڊنگ کي روڪڻ لاءِ گيٽ ڪري سگهجي ٿو ته جيئن سبسٽريٽ انبيوشن کي روڪي سگهجي. اپوليپوپروٽين جي QB سائيٽ جي ويجهو ڪوئنولول ۽ ڪوئنون جو رابطو مختلف ٿي سگهي ٿو، جيڪو RC پاران ان جي رد ٿيڻ جو سبب بڻجي ٿو. اهو ڊگهي عرصي کان تجويز ڪيو ويو آهي ته ڪنفرميشنل تبديليون ڪوئنون جي بائنڊنگ ۽ گهٽتائي ۾ ڪردار ادا ڪن ٿيون. منجمد RCs جي صلاحيت ڪارو موافقت کان پوءِ ڪوئنون کي گهٽائڻ لاءِ خراب ٿي وئي آهي (36)؛ ايڪس ري ڪرسٽلوگرافي ڏيکاري ٿي ته هي نقصان QB ڪوئنون جي فعال پروڪسمل پوزيشن کان تقريباً 4.5 Å "ڊسٽل" ڪنفرميشن ۾ ڦاسي پوڻ جي ڪري آهي (26)، 37). اسان جو مشورو آهي ته هي ڊسٽل بائنڊنگ ڪنفارميشن اپوليپوپروٽين ۽ مڪمل رنگ جي جوڙجڪ جي وچ ۾ وچولي حالت جو هڪ سنيپ شاٽ آهي، جيڪو ڪوئنون سان شروعاتي رابطي ۽ QB سائيٽ جي افتتاح جي پٺيان آهي.
ڪجهه فوٽوٽروفڪ بيڪٽيريا ۽ سائانو بيڪٽيريا، الجي ۽ ٻوٽن جي PSII ڪمپليڪس ۾ مليل قسم II RC ۾ ساختي ۽ فنڪشنل تحفظ آهي (38). شڪل 6 (D ۽ E) ۾ ڏيکاريل ساختي ترتيب PSII RCs ۽ بيڪٽيريا RC ڪمپليڪس جي QB سائيٽ جي وچ ۾ هڪجهڙائي تي زور ڏئي ٿي. هي مقابلو ڊگهي عرصي کان ڪوئنون بائنڊنگ ۽ ريڊڪشن جي ويجهي سان لاڳاپيل سسٽم جي مطالعي لاءِ هڪ ماڊل رهيو آهي. پوئين اشاعتن تجويز ڪيو ته ڪنفرميشنل تبديليون ڪوئنونز جي PSII گهٽتائي سان گڏ آهن (39، 40). تنهن ڪري، RC جي ارتقائي تحفظ تي غور ڪندي، هي اڳ ۾ غير مشاهدو ٿيل بائنڊنگ ميڪانيزم آڪسيجن ٿيل فوٽوٽروفڪ ٻوٽن ۾ PSII RC جي QB سائيٽ تي پڻ لاڳو ٿي سگهي ٿو.
Rps ΔpufW (غير ليبل ٿيل pufW حذف ٿيل) ۽ PufW-His (سي-ٽرمينل 10x His-tagged پروٽين-W قدرتي pufW لوڪس مان ظاهر ڪيل) اسٽرين. palustris CGA009 اسان جي پوئين ڪم (16) ۾ بيان ڪيو ويو هو. اهي اسٽرين ۽ آئسوجينڪ جهنگلي قسم جي والدين کي فريزر مان PYE (هر 5 گرام ليٽر -1) (-80 °C تي LB ۾ ذخيرو ٿيل، 50٪ (w/v) گليسرول) پروٽين، خمير ڪڍڻ ۽ succinate) آگر [1.5٪ (w/v)] پليٽ تي ٿوري تعداد ۾ سيلز کي اسٽريڪ ڪندي حاصل ڪيو ويو. پليٽ کي رات جو اونداهي ۾ ڪمري جي حرارت تي اينروبڪ حالتن ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ OSRAM 116-W هالوجن بلب (RS Components، UK) پاران مهيا ڪيل اڇي روشني (~50 μmolm-2 s-1) سان روشن ڪيو ويو 3 کان 5 ڏينهن تائين جيستائين هڪ ڪالوني ظاهر نه ٿئي. هڪ ڪالوني ۾ 10 ملي ليٽر M22+ ميڊيم (41) کي 0.1٪ (w/v) ڪيسامينو ايسڊ (هتي M22 سڏيو ويندو) سان گڏ ڪيو ويو. ڪلچر کي گهٽ آڪسيجن واري حالتن ۾ اونداهي ۾ 34 ° C تي 180 rpm تي 48 ڪلاڪن لاءِ ڇڪڻ سان پوکيو ويو، ۽ پوءِ 70 ملي ليٽر ڪلچر کي ساڳئي حالتن ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ ٽيڪو ڪيو ويو. 1 ملي ليٽر جي مقدار سان هڪ نيم ايروبڪ ڪلچر 30 ملي ليٽر يونيورسل اسڪرو ٽاپ شفاف شيشي جي بوتل ۾ M22 ميڊيم جي 30 ملي ليٽر کي ٽيڪو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ۽ جراثيم کان پاڪ مقناطيسي قوت اسٽيرنگ راڊ ذريعي 48 ڪلاڪن لاءِ ايجيٽيشن (~50μmolm-2 s-1) سان شعاع ڪيو ويندو آهي. پوءِ ڪلچر جي 30 ملي ليٽر کي ساڳئي حالتن ۾ تقريباً 1 ليٽر ڪلچر سان ٽيڪو ڪيو ويو، جيڪو پوءِ 72 ڪلاڪن لاءِ ~200 μmolm-2 s-1 تي روشن ٿيل تقريباً 9 ليٽر ڪلچر کي ٽيڪو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. سيلز کي سينٽرفيوگيشن ذريعي 7132 RCF تي 30 منٽن لاءِ حاصل ڪيو ويو، 20 mM ٽريس-HCl (pH 8.0) جي ~10 ml ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو، ۽ ضرورت تائين -20 ° C تي ذخيرو ڪيو ويو.
پگھلڻ کان پوءِ، ڊي آڪسي رائيبونڪليئس I (مرڪ، برطانيه)، لائسوزائم (مرڪ، برطانيه) ۽ ٻه روش هولو اينزائم پروٽيز انابيٽر ٽيبلٽس (مرڪ، برطانيه) جا ڪجهه ڪرسٽل ٻيهر معطل ٿيل سيلز ۾ شامل ڪريو. 20,000 psi فرينچ پريشر سيل (امينڪو، آمريڪا) ۾، سيلز کي 8 کان 12 ڀيرا خراب ڪيو ويو. 4°C تي 15 منٽن لاءِ 18,500 RCF تي سينٽريفيوگيشن ذريعي اڻ ٽٽل سيلز ۽ غير حل ٿيندڙ ملبے کي هٽائڻ کان پوءِ، جھلي کي 113,000 RCF تي 43,000°C تي 2 ڪلاڪن لاءِ سينٽريفيوگيشن ذريعي پگمينٽڊ لائسيٽ مان ڪڍيو ويو. حل ٿيندڙ حصي کي رد ڪريو ۽ رنگين جھلي کي 100 کان 200 ملي ليٽر 20 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل (پي ايڇ 8.0) ۾ ٻيهر معطل ڪريو ۽ هڪجهڙائي ڪريو جيستائين ڪو به نظر نه ايندڙ مجموعو نه هجي. معطل ٿيل جھلي کي 20 ملي ميٽر ٽريس-ايڇ سي ايل (پي ايڇ 8.0) (ايناتريس، آمريڪا) ۾ 2٪ (w/v) β-DDM تي مشتمل 1 ڪلاڪ لاءِ اونداهي ۾ 4°C تي هلڪي هلڪي حرڪت سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. پوءِ سينٽريفيوج 70°C تي 150,000 RCF کي 4°C تي 1 ڪلاڪ لاءِ حل ڪرڻ لاءِ باقي غير حل ٿيندڙ شيون ختم ڪرڻ لاءِ.
ΔpufW اسٽرين مان حل ٿيندڙ جھلي کي 50 ml DEAE Sepharose آئن ايڪسچينج ڪالم تي لاڳو ڪيو ويو جنهن ۾ ٽن ڪالمن واليوم (CV) بائنڊنگ بفر [20 mM tris-HCl (pH 8.0) شامل هئا جنهن ۾ 0.03% (w / v) β-DDM شامل هئا]. ڪالم کي ٻن CV بائنڊنگ بفرن سان ڌوئو، ۽ پوءِ ڪالم کي ٻن بائنڊنگ بفرن سان ڌوئو جنهن ۾ 50 mM NaCl شامل هئا. RC-LH116 ڪمپليڪس کي 1.75 CV تي 150 کان 300 mM NaCl (بائنڊنگ بفر ۾) جي لڪير گريڊينٽ سان ايليوٽ ڪيو ويو، ۽ باقي بائنڊنگ ڪمپليڪس کي 0.5 CV تي 300 mM NaCl شامل هئا جنهن ۾ بائنڊنگ بفر سان ايليوٽ ڪيو ويو. 250 ۽ 1000 nm جي وچ ۾ جذب ​​اسپيڪٽرم گڏ ڪريو، جذب تناسب (A880/A280) سان فريڪشن کي 1 کان وڌيڪ 880 کان 280 nm تي رکو، ان کي بائنڊنگ بفر ۾ ٻه ڀيرا پتلو ڪريو، ۽ DEAE ڪالم آن پيوريفڪيشن تي ساڳيو طريقو ٻيهر استعمال ڪريو. A880/A280 تناسب 1.7 کان وڌيڪ ۽ A880/A805 تناسب 3.0 کان وڌيڪ سان فريڪشن کي پتلو ڪريو، آئن ايڪسچينج جو ٽيون دور انجام ڏيو، ۽ A880/A280 تناسب 2.2 کان وڌيڪ ۽ A880/A805 تناسب 5.0 کان وڌيڪ سان فريڪشن کي برقرار رکو. جزوي طور تي صاف ٿيل ڪمپليڪس کي اميڪن 100,000 ماليڪيولر ويٽ ڪٽ آف (MWCO) سينٽريفيوگل فلٽر (مرڪ، برطانيه) ۾ ~2 ملي ليٽر تائين مرڪوز ڪيو ويو، ۽ هڪ سپرڊيڪس 200 16/600 سائيز ايڪسڪلوشن ڪالم (GE هيلٿ ڪيئر، يو ايس) تي لوڊ ڪيو ويو جنهن ۾ 200 ايم ايم NaCl بفر شامل هو، ۽ پوءِ ساڳئي بفر ۾ 1.5 سي وي تي ايلوٽ ڪيو ويو. سائيز ايڪسڪلوشن فريڪشن جي جذب اسپيڪٽرا کي گڏ ڪريو، ۽ جذب اسپيڪٽرا کي 2.4 کان مٿي A880/A280 تناسب ۽ 5.8 کان 100 A880 کان مٿي A880/A805 تناسب سان مرڪوز ڪريو، ۽ فوري طور تي انهن کي ڪرائو-ٽيم گرڊ تيار ڪرڻ يا اسٽوريج لاءِ استعمال ڪريو جيستائين ضرورت هجي -80°C تي رکو.
PufW-His strain مان solubilizing membrane کي 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ڪالم (20 mM tris-HCl (pH 8.0) تي لاڳو ڪيو ويو جنهن ۾ 200 mM NaCl ۽ 0.03% (w/w)) شامل آهن IMAC بفر (GE Healthcare). v) β-DDM]. ڪالم کي IMAC بفر جي پنجن CVs سان ڌوئڻ ۾ مدد ڪئي وئي، ۽ پوءِ IMAC بفر جي پنجن CVs سان 10 mM هسٽيڊائن تي مشتمل. ڪور ڪمپليڪس کي ڪالم مان 100 mM هسٽيڊائن تي مشتمل پنج IMAC بفرن سان ايلوٽ ڪيو ويو. RC-LH114-W ڪمپليڪس تي مشتمل حصو اميڪن 100,000 MWCO فلٽر (Merck، UK) سان ليس هڪ اسٽيرڊ ٽينڪ ۾ ~10 ml تائين مرڪوز ڪيو ويو، بائنڊنگ بفر سان 20 ڀيرا پتلو ڪيو ويو، ۽ پوءِ 25 ml ۾ شامل ڪيو ويو DEAE Sepharose ڪالم ۾، بفر سان ڳنڍيل چار CVs اڳ ۾ استعمال ڪيا ويندا آهن. ڪالم کي چار سي وي بائنڊنگ بفرن سان ڌوئو، پوءِ ڪمپليڪس کي اٺ سي وي تي 0 کان 100 ايم ايم NaCl (بائنڊنگ بفر ۾) جي لڪير گريڊينٽ تي ايلوٽ ڪريو، ۽ باقي چار سي وي جن ۾ 100 ايم ايم بائنڊنگ بفر شامل آهن. سوڊيم ڪلورائڊ تي ايلوٽ ٿيل باقي ڪمپليڪس 2.4 کان وڌيڪ A880/A280 تناسب ۽ 4.6 کان وڌيڪ A880/A805 تناسب سان گڏ هڪ اميڪن 100,000 MWCO سينٽرفيوگل فلٽر ۾ ~2 ملي ليٽر تائين مرڪوز ڪيا ويا، ۽ اڳواٽ 1.5 سي وي IMAC سان ڀريو ويو بفر سپرڊيڪس 200 16/600 سائيز خارج ڪرڻ واري ڪالم کي متوازن ڪيو، ۽ پوءِ ساڳئي بفر ۾ 1.5 سي وي کان مٿي ايلوٽ ڪيو ويو. سائيز-خارج ڪيل حصن جي جذب اسپيڪٽرا کي گڏ ڪريو ۽ جذب اسپيڪٽرا کي 2.1 کان مٿي A880/A280 تناسب ۽ 4.6 کان 100 A880 کان مٿي A880/A805 تناسب سان مرڪوز ڪريو، جيڪي فوري طور تي منجمد TEM گرڊ تيار ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيا ويندا آهن يا ضرورت تائين -80°C تي ذخيرو ڪيا ويندا آهن.
گهٽ درجه حرارت واري TEM گرڊ تيار ڪرڻ لاءِ هڪ Leica EM GP وسرجن فريزر استعمال ڪيو ويو. ڪمپليڪس کي IMAC بفر ۾ 50 جي A880 تي ملائي ڇڏيو ويو، ۽ پوءِ 5μl کي نئين چمڪ سان خارج ٿيندڙ QUANTIFOIL 1.2/1.3 ڪاربن ڪوٽيڊ ڪاپر ميش تي لوڊ ڪيو ويو (Agar Scientific, UK). گرڊ کي 20°C ۽ 60% نسبتي نمي تي 30 سيڪنڊن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، پوءِ ان کي 3 سيڪنڊن لاءِ سڪايو، ۽ پوءِ ان کي -176°C تي مائع ايٿين ۾ بجھو.
RC-LH114-W ڪمپليڪس جو ڊيٽا eBIC (اليڪٽرانڪ بايو اميجنگ سينٽر) (برٽش ڊائمنڊ لائيٽ سورس) تي ٽائيٽن ڪريوس مائڪرو اسڪوپ سان رڪارڊ ڪيو ويو، جيڪو 300kV جي تيز رفتار وولٽيج تي ڪم ڪري ٿو، 130,000× جي نامياري ميگنيفڪيشن سان ۽ 20 eV جي گيپ چونڊيو توانائي سان. ڊيٽا گڏ ڪرڻ لاءِ ڳڻپ واري موڊ ۾ تصويرون رڪارڊ ڪرڻ لاءِ هڪ Gatan 968 GIF Quantum with K2 Peak Detector استعمال ڪيو ويو. ڪيليبريٽر ٿيل پکسل سائيز 1.048Å آهي، ۽ دوز جي شرح 3.83 e-Å-2s-1 آهي. فلم کي 11 سيڪنڊن ۾ گڏ ڪيو ۽ ان کي 40 حصن ۾ ورهايو. مائڪرو اسڪوپ کي ٻيهر فوڪس ڪرڻ لاءِ ڪاربان ڪوٽيڊ ايريا استعمال ڪريو، ۽ پوءِ هر سوراخ ۾ ٽي فلمون گڏ ڪريو. ڪل، 3130 فلمون گڏ ڪيون ويون، جن ۾ -1 ۽ -3μm جي وچ ۾ ڊيفوڪس ويليوز هئا.
آر سي-ايل ايڇ 116 ڪمپليڪس لاءِ ڊيٽا ايسٽربري بايو اسٽرڪچر ليبارٽري (يونيورسٽي آف ليڊز، برطانيه) ۾ ساڳئي خوردبيني استعمال ڪندي گڏ ڪيو ويو. ڊيٽا 130 ڪلو ميٽر جي ميگنيفڪيشن سان ڳڻپ واري موڊ ۾ گڏ ڪيو ويو، ۽ پکسل سائيز کي 4.6 اي-Å-2s-1 جي دوز سان 1.065 Å تائين ڪيليبريٽ ڪيو ويو. فلم 12 سيڪنڊن ۾ رڪارڊ ڪئي وئي ۽ 48 حصن ۾ ورهائي وئي. ڪل، 3359 فلمون گڏ ڪيون ويون، جن ۾ -1 ۽ -3μm جي وچ ۾ ڊيفوڪس ويليوز هئا.
سڀ ڊيٽا پروسيسنگ ريلين 3.0 پائپ لائن (42) ۾ ڪئي ويندي آهي. ڊوز ويٽنگ ذريعي بيم موشن کي درست ڪرڻ لاءِ موشن ڪور 2 (43) استعمال ڪريو، ۽ پوءِ CTF (ڪنٽراسٽ ٽرانسفر فنڪشن) پيرا ميٽر کي طئي ڪرڻ لاءِ CTFFIND 4.1 (44) استعمال ڪريو. انهن شروعاتي پروسيسنگ مرحلن کان پوءِ عام فوٽو مائڪروگراف شڪل 2. S16 ۾ ڏيکاريا ويا آهن. خودڪار چونڊ ٽيمپليٽ 250-پڪسل فريم ۾ 1000 ذرڙن جي لڳ ڀڳ 250 پکسلز کي دستي طور تي چونڊڻ ۽ ڪو به حوالو ٻه-dimensional (2D) درجه بندي نه هجڻ سان پيدا ڪيو ويندو آهي، انهي ڪري انهن درجه بندي کي رد ڪيو ويندو آهي جيڪي نموني جي آلودگي کي پورا ڪن ٿا يا ڪا به قابل ذڪر خاصيتون نه آهن. پوءِ، سڀني مائڪرو فوٽوگرافس تي خودڪار چونڊ ڪئي وئي، ۽ RC-LH114-W 849,359 ذرڙا هئا، ۽ RC-LH116 ڪمپليڪس 476,547 ذرڙا هئا. سڀئي چونڊيل ذرڙا غير ريفرنس 2D درجه بندي جا ٻه دور گذريا آهن، ۽ هر رن کان پوءِ، اهي ذرڙا جيڪي ڪاربن ايريا، نموني جي آلودگي، ڪا به واضح خاصيت يا مضبوطي سان اوورليپنگ ذرات سان ملن ٿا، رد ڪيا ويا آهن، جنهن جي نتيجي ۾ 772,033 (90.9٪) ۽ 359,678 (75.5٪) ذرات RC-LH114-W ۽ RC-LH116 جي 3D درجه بندي لاءِ ترتيب وار استعمال ڪيا ويا آهن. شروعاتي 3D ريفرنس ماڊل اسٽوچسٽڪ گريڊينٽ ڊيسنٽ طريقو استعمال ڪندي تيار ڪيو ويو هو. شروعاتي ماڊل کي ريفرنس طور استعمال ڪندي، چونڊيل ذرڙن کي 3D ۾ چار درجن ۾ ورهايو ويو آهي. هن درجي ۾ ماڊل کي ريفرنس طور استعمال ڪندي، سڀ کان وڏي درجي ۾ ذرڙن تي 3D ريفائننگ ڪريو، پوءِ سالوينٽ ايريا کي ڍڪڻ لاءِ شروعاتي 15Å لو-پاس فلٽر استعمال ڪريو، نرم ڪنارن جا 6 پکسلز شامل ڪريو، ۽ مٿين ڊيڪٽر جي Gatan K2 چوٽي ماڊوليشن ٽرانسفر فنڪشن کي درست ڪرڻ لاءِ پکسلز کي پوسٽ پروسيس ڪريو. RC-LH114-W ڊيٽاسيٽ لاءِ، هن شروعاتي ماڊل کي ماسڪ جي ڪنارن تي مضبوط کثافت کي هٽائي تبديل ڪيو ويو (UCSF چميرا ۾ ڪور ڪمپليڪس کثافت کان ڌار ٿيل). نتيجي ۾ ماڊل (RC-LH114-W ۽ RC-LH116 جا ريزوليوشن ترتيب وار 3.91 ۽ 4.16 Å آهن) 3D درجه بندي جي ٻئي دور لاءِ هڪ حوالي طور استعمال ڪيا ويا آهن. استعمال ٿيل ذرات شروعاتي 3D ڪلاس ۾ گروپ ڪيا ويا آهن ۽ پاڙيسري سان مضبوط لاڳاپو نه آهن. اوورليپ يا واضح ساخت جي خاصيتن جي کوٽ. 3D درجه بندي جي ٻئي دور کان پوءِ، سڀ کان وڌيڪ ريزوليوشن واري ڪيٽيگري کي چونڊيو ويو [RC-LH114-W لاءِ، هڪ ڪيٽيگري 377,703 ذرڙا (44.5٪) آهي، RC-LH116 لاءِ، ٻه ڪيٽيگريون آهن، ڪل 260,752 ذرڙا (54.7٪)، جتي اهي صرف ساڳيا آهن جڏهن شروعاتي گردش کان پوءِ هڪ ننڍڙي فرق سان ترتيب ڏنل آهن]. چونڊيل ذرڙن کي 400-پڪسل باڪس ۾ ٻيهر ڪڍيو ويندو آهي ۽ 3D ريفائننگ ذريعي صاف ڪيو ويندو آهي. سالوينٽ ماسڪ شروعاتي 15Å لو-پاس فلٽر، 3 پکسل ميپ ايڪسپينشن ۽ 3 پکسل سوفٽ ماسڪ استعمال ڪندي تيار ڪيو ويندو آهي. في پارٽيڪل CTF ريفائنمينٽ، في پارٽيڪل موشن ڪرڪشن ۽ في پارٽيڪل CTF ريفائنمينٽ جو ٻيو دور استعمال ڪندي، 3D ريفائنمينٽ، سالوينٽ ماسڪنگ ۽ پوسٽ پروسيسنگ هر قدم کان پوءِ ڪيا ويندا آهن ته جيئن نتيجي ۾ بناوت کي وڌيڪ بهتر بڻائي سگهجي. FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ڪٽ آف ويليو 0.143 استعمال ڪندي، RC-LH114-W ۽ RC-LH116 جي آخري ماڊلز جي ريزوليوشن ترتيب وار 2.65 ۽ 2.80Å آهن. آخري ماڊل جو FSC وکر شڪل 2. S17 ۾ ڏيکاريو ويو آهي.
سڀئي پروٽين جي ترتيب UniProtKB مان ڊائون لوڊ ڪيا ويا آهن: LH1-β (PufB؛ UniProt ID: Q6N9L5)؛ LH1-α (PufA؛ UniProt ID: Q6N9L4)؛ RC-L (PufL؛ UniProt ID: O83005)؛ RC-M (PufM؛ UniProt ID: A0A4Z7)؛ RC-H (PuhA؛ UniProt ID: A0A4Z9)؛ پروٽين-W (PufW؛ UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) کي RC جي هڪ هومولوجي ماڊل ٺاهڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، جنهن ۾ RC-L، RC-M ۽ RC-H جي پروٽين جي ترتيب ۽ Rba جي ڪرسٽل structure شامل آهن. sphaeroides RC کي ٽيمپليٽ (PDB ID: 5LSE) (46) طور استعمال ڪيو ويو. UCSF Chimera ۾ "fit map" ٽول استعمال ڪريو ته جيئن ٺاهيل ماڊل کي نقشي ۾ فٽ ڪري سگهجي (47)، پروٽين جي جوڙجڪ کي بهتر بڻائي سگهجي، ۽ ڪوفيڪٽر [4×BChl a (مونومر لائبريري ريزيڊيو نالو = BCL)، 2×BPh a (BPH)، هڪ يا ٻه قسم UQ10 (U10)، هڪ غير هيم آئرن (Fe) ۽ هڪ 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] شامل ڪرڻ لاءِ Coot (48) استعمال ڪري سگهجي. جيئن ته QAK مونومر لائبريري ۾ موجود ناهي، ان کي PHENIX (49) ۾ eLBOW ٽول استعمال ڪندي پيرا ميٽرائيز ڪيو ويو.
اڳيون، LH1 سب يونٽ ٺاهيو ويو. شروعات ۾، PHENIX (49) ۾ خودڪار تعميراتي اوزار نقشي ۽ LH1-α ۽ LH1-β پروٽين جي ترتيبن کي ان پٽ طور استعمال ڪندي LH1 تسلسل جو حصو خودڪار طريقي سان تعمير ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. سڀ کان مڪمل LH1 سب يونٽ چونڊيو، ان کي ڪڍو ۽ ان کي Coot ۾ لوڊ ڪريو، دستي طور تي ان ۾ گم ٿيل تسلسل شامل ڪريو، ۽ دستي طور تي ٻه BCls a (BCL) ۽ هڪ spirilloxanthin (CRT) شامل ڪرڻ کان اڳ پوري ڍانچي کي بهتر ڪريو [لاڳاپيل Rps مطابق LH1 ڪمپليڪس جي کثافت ۽ ڄاتل سڃاتل ڪيروٽينائيڊ مواد. جنسون (17)]. مڪمل LH1 سب يونٽ کي نقل ڪريو، ۽ UCSF Chimera "ڊاڪنگ ميپ ٽول" استعمال ڪريو LH1 کثافت جي ڀرسان غير ماڊل علائقي ۾ ڊاک ڪرڻ لاءِ، ۽ پوءِ ان کي Coot ۾ بهتر ڪريو؛ عمل کي ورجايو جيستائين سڀئي LH1 سب يونٽ ماڊل نه ٿي وڃن. RC-LH114-W structure لاءِ، Coot ۾ غير مختص ڪيل کثافت کي ڪڍڻ سان، پروٽين کي USCF Chimera نقشي ۾ باقي غير پروٽين حصن مان ورهايو ويندو آهي ۽ آٽو بلڊ ٽول کي شروعاتي ماڊل، ۽ باقي سب يونٽ (پروٽين-W) ماڊلنگ قائم ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. PHENIX (49) ۾. Coot (48) ۾ نتيجي ۾ ماڊل ۾ ڪو به گم ٿيل تسلسل شامل ڪريو، ۽ پوءِ دستي طور تي پوري سب يونٽ کي بهتر ڪريو. باقي غير مختص ڪيل کثافت لپڊس (CDL = CDL، POPC = 6PL ۽ POPG = PGT جي PDB مونومر لائبريري ID)، β-DDM ڊٽرجنٽ (LMT) ۽ UQ10 ماليڪيولز (U10) جي ميلاپ سان ٺهڪي اچي ٿي. مڪمل شروعاتي ماڊل کي مڪمل ڪرڻ لاءِ Coot (48) ۾ PHENIX آپٽمائيزيشن (49) ۽ مينوئل آپٽمائيزيشن استعمال ڪريو جيستائين ماڊل جي شماريات ۽ فٽ جي بصري معيار کي وڌيڪ بهتر نه ڪيو وڃي. آخرڪار، مقامي نقشي کي تيز ڪرڻ لاءِ LocScale (50) استعمال ڪريو، ۽ پوءِ غير مختص ڪيل کثافت ۽ خودڪار ۽ دستي آپٽمائيزيشن جي ماڊلنگ جا ڪيترائي ٻيا چڪر انجام ڏيو.
لاڳاپيل پيپٽائڊس، ڪوفيڪٽرز ۽ ٻيا لپڊس ۽ ڪوئنون جيڪي انهن جي لاڳاپيل کثافت ۾ ڊاک ٿيل آهن، شڪل 1 ۽ 2 ۾ ڏيکاريا ويا آهن. S18 کان S23 تائين. آخري ماڊل جي شمارياتي معلومات ٽيبل S1 ۾ ڏيکاريل آهي.
جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو هجي، UV/Vis/NIR جذب اسپيڪٽرا کي Cary60 اسپيڪٽرو فوٽوميٽر (Agilent، USA) تي 1 nm وقفي تي 250 nm کان 1000 nm ۽ 0.1s جي انضمام وقت تي گڏ ڪيو ويو.
نموني کي ڪوارٽز ڪيويٽ ۾ 2 ملي ميٽر رستي سان 1 جي A880 تائين پتلي ڪريو، ۽ 400 ۽ 1000 nm جي وچ ۾ جذب ​​اسپيڪٽرم گڏ ڪريو. گول ڊائڪروڪ اسپيڪٽرا کي Jasco 810 اسپيڪٽروپوليرميٽر (Jasco، جاپان) تي 1 nm وقفي تي 400 nm ۽ 950 nm جي وچ ۾ 20 nm منٽ-1 جي اسڪين جي شرح سان گڏ ڪيو ويو.
مولر ايڪسٽينشن ڪوفيشينٽ جو تعين ڪور ڪمپليڪس کي تقريبن 50 جي A880 تائين گهٽائڻ سان ڪيو ويندو آهي. 10μl حجم کي 990μl بائنڊنگ بفر يا ميٿانول ۾ پتلي ڪريو، ۽ BChl جي خرابي کي گھٽ ڪرڻ لاءِ فوري طور تي جذب اسپيڪٽرم گڏ ڪريو. هر ميٿانول نموني جي BChl مواد کي 54.8 mM-1 cm-1 جي 771 nm تي ايڪسٽينشن ڪوفيشينٽ ذريعي ڳڻيو ويو، ۽ ايڪسٽينشن ڪوفيشينٽ جو تعين ڪيو ويو (51). ماپيل BChl ڪنسنٽريشن کي 32 (RC-LH114-W) يا 36 (RC-LH116) سان ورهايو ته جيئن ڪور ڪمپليڪس ڪنسنٽريشن جو تعين ڪري سگهجي، جيڪو پوءِ بفر ايڪسٽينشن ڪوفيشينٽ ۾ گڏ ڪيل ساڳئي نموني جي جذب اسپيڪٽرم کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. متوازي. هر نموني لاءِ ٽي بار بار ماپون ڪيون ويون، ۽ BChl Qy جي وڌ ۾ وڌ جذب کي حساب لاءِ استعمال ڪيو ويو. 878 nm تي ماپيل RC-LH114-W جو ختم ٿيڻ جو ڪوئفيشينٽ 3280±140 mM-1 cm-1 آهي، جڏهن ته 880 nm تي ماپيل RC-LH116 جو ختم ٿيڻ جو ڪوئفيشينٽ 3800±30 mM-1 cm-1 آهي.
UQ10 کي (52) ۾ ڏنل طريقي مطابق مقدار ۾ طئي ڪيو ويو. مختصر ۾، ريورس فيز HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC سسٽم استعمال ڪندي ڪيو ويو. RC-LH116 يا RC-LH114-W جي 0.02 nmol کي 50μl 50:50 ميٿانول ۾ حل ڪريو: ڪلوروفارم جنهن ۾ 0.02% (w/v) فيرڪ ڪلورائڊ شامل آهي، ۽ اڳ ۾ متوازن بيڪمن ڪولٽر الٽراسفير ODS 4.6 ملي ميٽر کي 1 ml-1 منٽ-1 ۾ HPLC سالوينٽ (80:20 ميٿانول:2-پروپانول) ۾ 40°C تي ×25 سينٽي ميٽر ڪالم تي انجيڪشن ڪريو. 275 nm (UQ10)، 450 nm (ڪيروٽينائيڊس) ۽ 780 nm (BChl) تي جذب جي نگراني ڪرڻ لاءِ HPLC سالوينٽ ۾ آئسوڪريٽڪ ايليوشن ڪريو 1 ڪلاڪ لاءِ. 275 nm ڪروميٽوگرام ۾ 25.5 منٽن تي چوٽي ضم ڪئي وئي هئي، جنهن ۾ ڪو به ٻيو ڳولڻ لائق مرکبات شامل نه هئا. ضم ٿيل علائقو 0 کان 5.8 nmol (شڪل S14) تائين خالص معيارن جي انجيڪشن مان ڳڻپيل ڪيل ڪيليبريشن وکر جي حوالي سان ڪڍيل UQ10 جي دالر مقدار کي ڳڻڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. هر نموني جو تجزيو ٽن نقلن ۾ ڪيو ويو، ۽ رپورٽ ٿيل غلطي سراسري جي SD سان ملندڙ جلندڙ آهي.
RC-LH1 ڪمپليڪس تي مشتمل هڪ محلول جنهن ۾ وڌ ۾ وڌ Qy جذب 0.1 هو، 30 μM گهٽ ٿيل گهوڙي جي دل جي سائيٽو ڪروم c2 (Merck، UK) ۽ 0 کان 50 μMUQ2 (Merck، UK) سان تيار ڪيو ويو. هر UQ2 ڪنسنٽريشن تي ٽي 1-ml نمونا تيار ڪيا ويا ۽ ماپ کان اڳ اونداهي ۾ مڪمل موافقت کي يقيني بڻائڻ لاءِ رات جو اونداهي ۾ 4°C تي انڪيوبيٽ ڪيا ويا. محلول کي OLIS RSM1000 ماڊيولر اسپيڪٽرو فوٽوميٽر ۾ لوڊ ڪيو ويو جيڪو 300 nm شعلو/500 لائن گريٽنگ، 1.24 mm انليٽ، 0.12 mm وچولي ۽ 0.6 mm آئوٽ ليٽ سلٽس سان ليس هو. نموني فوٽوٽيوب ۽ ريفرنس فوٽو ملٽيپليئر ٽيوب جي داخلا تي هڪ 600 nm ڊگهو پاس فلٽر رکيل آهي ته جيئن جوش جي روشني کي خارج ڪري سگهجي. جذب جي نگراني 550 nm تي 0.15 سيڪنڊن جي انضمام وقت سان ڪئي وئي. جوش واري روشني 880 nm M880F2 LED (لائيٽ ايميٽنگ ڊائوڊ) (Thorlabs Ltd., UK) مان 90٪ شدت تي فائبر آپٽڪ ڪيبل ذريعي DC2200 ڪنٽرولر (Thorlabs Ltd., UK) ذريعي خارج ٿئي ٿي ۽ 90° جي زاويه تي روشني جي ذريعن ڏانهن خارج ٿئي ٿي. ماپڻ واري شعاع آئيني جي مخالف آهي ته جيئن ڪنهن به روشني کي واپس ڪري سگهجي جيڪا شروعاتي طور تي نموني پاران جذب نه ڪئي وئي هئي. 50 سيڪنڊن جي روشني کان اڳ 10 سيڪنڊن جي جذب جي نگراني ڪريو. پوءِ اونداهي ۾ 60 سيڪنڊن لاءِ جذب جي وڌيڪ نگراني ڪئي وئي ته جيئن اندازو لڳائي سگهجي ته ڪوئنولول ڪيتري حد تائين خود بخود سائيٽو ڪروم c23 + کي گھٽائي ٿو (خام ڊيٽا لاءِ شڪل S8 ڏسو).
ڊيٽا کي 0.5 کان 10 سيڪنڊن اندر هڪ لڪير واري شروعاتي شرح کي فٽ ڪندي (UQ2 ڪنسنٽريشن تي منحصر ڪري) ۽ هر UQ2 ڪنسنٽريشن تي سڀني ٽنهي نمونن جي شرحن جي اوسط سان پروسيس ڪيو ويو. لاڳاپيل ايڪسٽينشن ڪوفيشيٽ پاران حساب ڪيل RC-LH1 ڪنسنٽريشن کي شرح کي ڪيٽيليٽڪ ڪارڪردگي ۾ تبديل ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو، جيڪو Origin Pro 2019 (OriginLab، USA) ۾ پلاٽ ڪيو ويو، ۽ ظاهري ڪلوميٽر ۽ Kcat قدرن کي طئي ڪرڻ لاءِ Michaelis-Menten ماڊل ۾ فٽ ڪيو ويو.
عارضي جذب جي ماپن لاءِ، RC-LH1 نموني کي IMAC بفر ۾ ~2μM تائين گھٽايو ويو جنهن ۾ 50 mM سوڊيم اسڪربيٽ (Merck، USA) ۽ 0.4 mM Terbutin (Merck، USA) شامل هئا. Ascorbic acid کي قرباني اليڪٽران ڊونر طور استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ tert-butaclofen کي QB inhibitor طور استعمال ڪيو ويندو آهي انهي کي يقيني بڻائڻ لاءِ ته مکيه RC ڊونر ماپ جي عمل دوران گهٽجي وڃي (يعني فوٽو آڪسائيڊ نه ڪيو وڃي). تقريبن 3 ml نموني کي هڪ ڪسٽم گھمڻ واري سيل (تقريبن 0.1 ميٽر قطر ۾، 350 RPM) ۾ 2 ملي ميٽر آپٽيڪل رستي جي ڊيگهه سان شامل ڪيو ويندو آهي انهي کي يقيني بڻائڻ لاءِ ته ليزر رستي ۾ نموني کي جوش جي دال جي وچ ۾ اونداهي موافقت لاءِ ڪافي وقت آهي. Ti: Sapphire ليزر سسٽم (Spectra Physics، USA) کي وڌائڻ لاءِ ~100-fs ليزر دال استعمال ڪريو 880 nm تي نموني کي 1 kHz (NIR لاءِ 20 nJ يا Vis لاءِ 100 nJ) جي ورجائي جي شرح تي جوش ڏيڻ لاءِ. ڊيٽا گڏ ڪرڻ کان اڳ، نموني کي تقريباً 30 منٽن لاءِ ايڪسائيٽيشن لائيٽ ۾ بي نقاب ڪريو. نمائش QA کي غير فعال ڪرڻ جو سبب بڻجندي (ممڪن طور تي هڪ يا ٻه ڀيرا QA کي گهٽائي). پر مهرباني ڪري نوٽ ڪريو ته هي عمل واپس ڪري سگهجي ٿو ڇاڪاڻ ته ڊگهي عرصي جي اونداهي موافقت کان پوءِ، RC آهستي آهستي QA سرگرمي ڏانهن موٽندو. هڪ هيليوس اسپيڪٽروميٽر (الٽرا فاسٽ سسٽم، آمريڪا) -10 کان 7000 پي ايس جي دير واري وقت سان ٽرانزينٽ اسپيڪٽرا کي ماپڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. ڊيٽا سيٽن کي غير گروپ ڪرڻ لاءِ سرفيس ايڪسپلورر سافٽ ويئر (الٽرا فاسٽ سسٽم، آمريڪا) استعمال ڪريو، پوءِ ضم ڪريو ۽ معياري بڻايو. ڪارپيٽ وييو سافٽ ويئر پيڪيج (لائيٽ ڪنورشن لميٽيڊ، لتھوانيا) استعمال ڪريو گڏيل ڊيٽا سيٽ کي استعمال ڪرڻ لاءِ ڊيڪي سان لاڳاپيل ڊفرنشل اسپيڪٽرا حاصل ڪرڻ لاءِ، يا هڪ فنڪشن استعمال ڪريو جيڪو ڪيترن ئي ايڪسپونٽن کي اوزار جي جواب سان گڏ ڪري ٿو ته جيئن Origin (OriginLab، آمريڪا) ۾ سنگل-ويولنگٿ اسپيڪٽرل ارتقا کي فٽ ڪري سگهجي.
جيئن مٿي ذڪر ڪيو ويو آهي (53)، هڪ فوٽوسنٿيٽڪ فلم تيار ڪئي وئي جنهن ۾ LH1 ڪمپليڪس شامل هو جنهن ۾ RC ۽ پردي LH2 اينٽينا ٻنهي جي کوٽ هئي. جھلي کي 20 mM ٽريس (pH 8.0) ۾ ملائي ڇڏيو ويو ۽ پوءِ 2 mm آپٽيڪل رستي سان ڪوارٽز ڪيويٽ ۾ لوڊ ڪيو ويو. نموني کي 540 nm تي -10 کان 7000 ps جي دير واري وقت سان جوش ڏيڻ لاءِ 30nJ ليزر پلس استعمال ڪيو ويو. Rps. pal نموني لاءِ بيان ڪيل ڊيٽا سيٽ کي پروسيس ڪريو.
جھلي کي سينٽرفيوگيشن ذريعي 150,000 RCF تي 2 ڪلاڪن لاءِ 4°C تي پيليٽ ڪيو ويو، ۽ پوءِ 880 nm تي ان جي جذب کي 20 mM ٽريس-HCl (pH 8.0) ۽ 200 mM NaCl ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو. 4°C تي اونداهي ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ 2% (w/v) β-DDM ۾ آهستي آهستي هلائيندي جھلي کي حل ڪريو. نموني کي 100 mM ٽرائيٿيلامونيم ڪاربونيٽ (pH 8.0) (TEAB؛ مرڪ، برطانيه) ۾ 2.5 mg ml-1 (بائيو-ريڊ تجزيو) جي پروٽين ڪنسنٽريشن تائين ملائي ڇڏيو ويو. وڌيڪ پروسيسنگ اڳ ۾ شايع ٿيل طريقي (54) کان ڪئي وئي، 50 μg پروٽين کي ڪل 50 μl TEAB ۾ ملائي 1% (w/v) سوڊيم لورٽ (Merck، برطانيه) تي مشتمل ڪيو ويو. 60 سيڪنڊن لاءِ سونيڪيشن کان پوءِ، ان کي 5 ايم ايم ٽريس (2-ڪاربوڪسيٿيل) فاسفائن (مرڪ، برطانيه) سان 37 ڊگري سينٽي گريڊ تي 30 منٽن لاءِ گھٽايو ويو. ايس-الڪيليشن لاءِ، نموني کي 10 ايم ايم ميٿائل ايس-ميٿائلٿيوميٿين سلفونيٽ (مرڪ، برطانيه) سان انڪيوبيٽ ڪريو ۽ ان کي 200 ايم ايم آئسوپروپينول اسٽاڪ محلول مان ڪمري جي حرارت تي 10 منٽن لاءِ شامل ڪريو. پروٽيوليٽڪ هضم 2 μg ٽرپسن/اينڊوپروٽينيز لائس-سي مرکب (پروميگا برطانيه) شامل ڪندي ڪيو ويو ۽ 37 ° سي تي 3 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. لورٽ سرفڪٽينٽ کي 50 μl ايٿائل ايسٽيٽ ۽ 10 μl 10٪ (v/v) ايل سي گريڊ ٽرائي فلورواسيٽڪ ايسڊ (TFA؛ ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، برطانيه) شامل ڪندي ۽ 60 سيڪنڊن لاءِ وورٽيڪسنگ ذريعي ڪڍيو ويو. مرحلي جي علحدگي کي 15,700 آر سي ايف تي 5 منٽن لاءِ سينٽرفيوگيشن ذريعي فروغ ڏنو ويو. ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول موجب، هڪ C18 اسپن ڪالم (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، برطانيه) پيپٽائيڊ تي مشتمل هيٺين مرحلي کي احتياط سان ايسپيريٽ ۽ ڊيسالٽ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. ويڪيوم سينٽرفيوگيشن ذريعي سڪي وڃڻ کان پوءِ، نموني کي 0.5٪ TFA ۽ 3٪ ايسٽونائيٽرائيل ۾ حل ڪيو ويو، ۽ 500 اين جي جو تجزيو نانو فلو آر پي ڪروميٽوگرافي سان گڏ ماس اسپيڪٽروميٽري سان گڏ اڳ ۾ بيان ڪيل سسٽم پيرا ميٽرز استعمال ڪندي ڪيو ويو.
پروٽين جي سڃاڻپ ۽ مقدار جي تصديق لاءِ MaxQuant v.1.5.3.30 (56) استعمال ڪريو Rps. palustris proteomes ڊيٽابيس (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) ڳولڻ لاءِ. ماس اسپيڪٽروميٽري پروٽومڪس ڊيٽا کي ڊيٽا سيٽ سڃاڻپ ڪندڙ PXD020402 جي تحت PRIDE پارٽنر ريپوزٽري (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ذريعي ProteomeXchange الائنس ۾ جمع ڪيو ويو آهي.
RPLC پاران اليڪٽرو اسپري آئنائيزيشن ماس اسپيڪٽروميٽري سان گڏ تجزيو ڪرڻ لاءِ، RC-LH1 ڪمپليڪس جهنگلي قسم جي Rps مان تيار ڪيو ويو هو. اڳ ۾ شايع ٿيل طريقو (16) استعمال ڪندي، پالسٽرس سيلز ۾ پيدا ٿيندڙ پروٽين جي ڪنسنٽريشن 20 mM هيپس (pH 7.8)، 100 mM NaCl ۽ 0.03% (w/v) β- (بائيو-ريڊ تجزيو)) DDM ۾ 2 mg ml-1 هئي. ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول جي مطابق، 2D صاف ڪرڻ واري ڪٽ (GE هيلٿ ڪيئر، USA) استعمال ڪريو ته جيئن 10 μg پروٽين کي ورن جي طريقي سان ڪڍي سگهجي، ۽ 20 μl 60% (v / v) فارمڪ ايسڊ (FA)، 20% (v / v) ايسٽونيٽرائل ۽ 20% (v / v) پاڻي ۾ پرسيپيٽ کي حل ڪري سگهجي. RPLC (Dionex RSLC) پاران ماس اسپيڪٽروميٽري (Maxis UHR-TOF، Bruker) سان گڏ پنج مائڪروليٽرز جو تجزيو ڪيو ويو. 60°C ۽ 100μlmin -1 تي الڳ ڪرڻ لاءِ MabPac 1.2×100 mm ڪالم (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، برطانيه) استعمال ڪريو، جنهن جو گريڊينٽ 85% (v / v) سالوينٽ A [0.1% (v / v) FA ۽ 0.02% (V / v) آبي محلول] کان 85% (v / v) سالوينٽ B [0.1% (v / v) FA ۽ 0.02% (v / v) 90% (v / v) ايسٽونائٽرائل TFA ۾ آهي] معياري اليڪٽرو اسپري آئنائيزيشن سورس ۽ ڊفالٽ پيرا ميٽرز کي 60 منٽن کان وڌيڪ استعمال ڪندي، ماس اسپيڪٽروميٽر 100 کان 2750 m/z (ماس-ٽو-چارج تناسب) حاصل ڪري ٿو. ExPASy بايو انفارميٽڪس ريسورس پورٽل FindPept ٽول (https://web.expasy.org/findpept/) جي مدد سان، ماس اسپيڪٽرم کي ڪمپليڪس جي ذيلي يونٽن سان نقشو ڪريو.
سيلز کي 72 ڪلاڪن تائين 100 ملي ليٽر NF-گهٽ (10μMm-2 s-1)، وچولي (30μMm-2 s-1) يا وڌيڪ (300μMm-2 s-1) روشني ۾ وڌايو ويو. M22 وچولي (M22 وچولي جنهن ۾ امونيم سلفيٽ کي ختم ڪيو ويندو آهي ۽ سوڊيم سڪسينيٽ کي سوڊيم ايسٽيٽ سان تبديل ڪيو ويندو آهي) 100 ملي ليٽر اسڪرو ٽاپ بوتل ۾ (23). پنج 30-s چڪر ۾، 0.1 مائڪرون شيشي جي موتي کي 1:1 جي مقدار جي تناسب تي سيلز کي لائز ڪرڻ لاءِ موتي ڪيو ويو ۽ 5 منٽن لاءِ برف تي ٿڌو ڪيو ويو. غير حل ٿيندڙ مادو، اڻ ٽٽل سيلز ۽ شيشي جي موتي کي 16,000 RCF تي سينٽرفيوگيشن ذريعي 10 منٽن لاءِ بينچ ٽاپ مائڪرو سينٽرفيوج ۾ هٽايو ويو. جھلي کي Ti 70.1 روٽر ۾ 100,000 RCF سان 20 mM ٽريس-HCl (pH 8.0) ۾ 40/15% (w/w) سکروز گريڊينٽ سان 10 ڪلاڪن لاءِ الڳ ڪيو ويو.
جيئن اسان جي پوئين ڪم ۾ بيان ڪيو ويو آهي، PufW (16) تي His ٽيگ جي اميونوڊٽيڪشن. مختصر ۾، 2x SDS لوڊنگ بفر (Merck، UK) ۾ RC جي ساڳئي ڪنسنٽريشن تي مشتمل پاڪ ٿيل ڪور ڪمپليڪس (11.8 nM) يا جھلي (گهٽايل فرق اسپيڪٽرم کي گھٽائڻ ۽ داغدار جيل تي لوڊ سان ملائي آڪسائيڊيشن ذريعي طئي ڪيو ويو) ٻه ڀيرا پتلي ڪئي وئي. پروٽين کي هڪ نقل 12٪ bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific، UK) تي الڳ ڪيو ويو. RC-L سب يونٽ کي لوڊ ڪرڻ ۽ ڏسڻ لاءِ هڪ جيل کي Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad، UK) سان داغ ڏنو ويو. ٻئي جيل تي پروٽين کي اميونوسائي لاءِ ميٿانول-فعال پوليوينائلائيڊين فلورائيڊ (PVDF) جھلي (Thermo Fisher Scientific، UK) ڏانهن منتقل ڪيو ويو. PVDF جھلي کي 50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl، 0.2% (v/v) Tween-20 ۽ 5% (w/v) اسڪيم ٿيل کير پائوڊر ۾ بلاڪ ڪيو ويو، ۽ پوءِ اينٽي هِس پرائمري اينٽي باڊي (اينٽي باڊي بفر کي ڊائلٽ ڪريو [50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl ۽ 0.05% (v/v) Tween-20] سان 1:1000 A190-114A، بيٿائل ليبارٽريز، آمريڪا ۾) 4 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. اينٽي باڊي بفر ۾ 5 منٽن لاءِ 3 ڀيرا ڌوئڻ کان پوءِ، جھلي کي هارسريڊش پيرو آڪسيڊيس (سگما-الڊرچ، برطانيه) اينٽي ماؤس سيڪنڊري اينٽي باڊي (اينٽي باڊي بفر ۾ 1:10,000 کي گهٽايو ويو) سان ملايو ويو ته جيئن ويسٽار اي ٽي اي سي 2.0 ڪيميلومينسنس سبسٽريٽ (سائناگين، اٽلي) ۽ ايمرشام ايمجر 600 (جي اي هيلٿ ڪيئر، برطانيه) استعمال ڪندي سڃاڻپ جي اجازت ڏئي سگهجي (اينٽي باڊي بفر ۾ 3 ڌوئڻ کان 5 منٽ پوءِ).
هر داغدار جيل يا اميونواسي لين جي شدت جي ورڇ کي ڊرائنگ ڪندي، چوٽي جي هيٺان علائقي کي ضم ڪندي ۽ RC-L (داغدار جيل) ۽ پروٽين-W (اميونواسي) جي شدت جي تناسب کي ڳڻڻ سان، ImageJ (57) ۾ تصوير کي پروسيس ڪريو. انهن تناسب کي اهو فرض ڪندي مولر تناسب ۾ تبديل ڪيو ويو ته خالص RC-LH114-W نموني ۾ RC-L جو پروٽين-W جو تناسب 1:1 هو ۽ ان مطابق پوري ڊيٽا سيٽ کي نارمل ڪيو ويو.
هن مضمون لاءِ اضافي مواد لاءِ، مهرباني ڪري ڏسو http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
هي هڪ کليل رسائي وارو مضمون آهي جيڪو ڪريٽو ڪامنز انتساب لائسنس جي شرطن تحت ورهايو ويو آهي. مضمون ڪنهن به ذريعن ۾ غير محدود استعمال، ورڇ، ۽ نقل جي اجازت ڏئي ٿو بشرطيڪه اصل ڪم صحيح طرح سان حوالو ڏنو ويو هجي.
نوٽ: اسان توهان کي صرف پنهنجو اي ميل پتو ڏيڻ لاءِ چئون ٿا ته جيئن توهان جنهن شخص کي صفحي تي سفارش ڪري رهيا آهيو اهو ڄاڻي ته توهان چاهيو ٿا ته اهي اي ميل ڏسن ۽ اهو اسپام نه آهي. اسان ڪو به اي ميل پتو نه پڪڙينداسين.
هي سوال جانچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته ڇا توهان هڪ مهمان آهيو ۽ خودڪار اسپام جمع ڪرائڻ کي روڪڻ لاءِ.
ڊيوڊ جي ڪي سوينسبري، پارڪ ڪيوان، فلپ جي جيڪسن، ڪيٽلن ايم فيريز، ڊاريوس ايم نيڊزويڊزڪي، ايلزبيٿ سي مارٽن، ڊيوڊ اي فارمر، لورنا اي ميلون، ريبيڪا ايف ٿامپسن، نيل اي رينسن، ڊينئل پي ڪينيف، مارڪ جي ڊڪمن، ڊيوي هولٽن، ڪرسٽين ڪرميئر، اينڊريو هچڪاڪ، سي نيل هنٽر
رد عمل مرڪز ۾ لائيٽ ٽريپ 1 ڪمپليڪس جي اعليٰ ريزوليوشن جوڙجڪ ڪوئنون ڊائنامڪس ۾ نئين بصيرت فراهم ڪري ٿي.
ڊيوڊ جي ڪي سوينسبري، پارڪ ڪيوان، فلپ جي جيڪسن، ڪيٽلن ايم فيريز، ڊاريوس ايم نيڊزويڊزڪي، ايلزبيٿ سي مارٽن، ڊيوڊ اي فارمر، لورنا اي ميلون، ريبيڪا ايف ٿامپسن، نيل اي رينسن، ڊينئل پي ڪينيف، مارڪ جي ڊڪمن، ڊيوي هولٽن، ڪرسٽين ڪرميئر، اينڊريو هچڪاڪ، سي نيل هنٽر
رد عمل مرڪز ۾ لائيٽ ٽريپ 1 ڪمپليڪس جي اعليٰ ريزوليوشن جوڙجڪ ڪوئنون ڊائنامڪس ۾ نئين بصيرت فراهم ڪري ٿي.
©2021 آمريڪن ايسوسيئيشن فار دي ايڊوانسمينٽ آف سائنس. سڀ حق محفوظ آهن. AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef ۽ COUNTER جو شريڪ آھي. سائنس ايڊوانسز ISSN 2375-2548.